实时荧光环介导等温扩增技术检测肉中沙门氏菌的研究

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由沙门氏菌引起的食源性疾病在公共卫生学上是一种具有重要意义的人畜共患病之一。每年至少有50%的食源性疾病是由沙门氏菌引起的,而检测沙门氏菌的方法通常是耗时长,特异性,灵敏度不高,这已经不适应时代的发展了,在飞速发展的今天迫切需要建立一种耗时短,高灵敏度,高特异性的检验沙门氏菌的方法。实时荧光LAMP法是在环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP)的基础上建立的一种新颖的核酸体外扩增技术,是在LAMP反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号来实时监控LAMP反应的进程。已经应用于检测病原菌等诸多领域。该方法具有操作简单、耗时短、实时监控等优点。本文针对沙门氏菌(Salmonella)保守的invA基因设计了一对特异性强的引物,本研究通过优化体系中Mg2+、dNTPs、Bet、Bst链置换聚合酶、模板的添加量以及体系的反应温度还有内外引物浓度比来确定适宜的扩增的体系和程序。已确定的反应体系是:2.5μL10×Bst buffer,镁离子(50mM)添加量为1μL,5μL dNTPs(2.5mM)混合物,Bst酶(8000U/ml)1μL,1μL甜菜碱(5M),模板DNA1.5μL,SYBR0.5μL,FIP和BIP引物(10mM)各2.5μL, F3和B3引物(10mM)各O.5μL,双蒸水6.5μL,总反应体系25μL,61℃反应1h。本研究为验证实时荧光LAMP引物的特异性选取了常见致病菌分别进行反应,结果表明:沙门氏菌显示阳性,而其它非沙门氏菌菌株均显示阴性。本研究比较了实时荧光LAMP方法与PCR方法检测纯菌的灵敏度,人工污染肉制品的检出限,结果表明:实时荧光LAMP检测沙门氏菌的灵敏度达到5.6×101CFU/mL。PCR检测沙门氏菌的灵敏度为5.6×102CFU/mL。实时荧光LAMP法和PCR法检测人工污染肉中沙门氏菌的检出限分别为5.6×104CFU/mL和5.6×105CFU/mL。本研究成功建立了实时荧光LAMP检测沙门氏菌的新方法,该方法特异性高、灵敏度高、方便快捷而且实时监控,为检测机构推广此技术提供了技术支持。
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