目的:脑出血(Intracerebral hemorrage,ICH)是常见的一种卒中类型,占10%-15%,是指颅内血管破裂,血液进入脑实质的过程,具有高发病率、高死亡率的特点。ICH后的血肿会压迫脑组织,导致机械损伤和继发损伤,包括变异应答、血脑屏障(blood-blood barrier,BBB)受损、神经元细胞死亡和神经功能缺损。在过去的10年中,ICH的发病率不断上升,入院率增加了18%。大约20%的ICH患者在手术治疗后遭受不同程度的神经功能障碍。尽管临床上已作出努力以减轻ICH和ICH后并发症,效果并不令人满意。脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMECs)形成的单层细胞结构是高度分化的BBB的一个组成部分。BMEC由连接蛋白连接到基底膜上,与周细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞终足和循环血细胞共同组成所谓的神经血管单元(neurovascular unit,NVU)。目前已经建立了许多永久化的脑内皮细胞细胞系,可以用来当充当体外BBB模型。这些细胞系与原代BMEC相比具有一定的优势,它们生长速度更快,而且在几代中保持稳定的细胞特征。然而,脑内皮细胞系不能完全替代原代细胞,因为很多重要的特点有所不同,不足以提供可靠的实验结果。因此,我们根据Ruck的方法,探索了分离原代BMEC的方法。MiR-126是由9号染色体上表皮生长因子样结构域7(epidermal growth factor-like-domain 7,EGFL7)基因的一个内含子编码的,有两个成熟的形态,miR-126-3p和miR-126-5p。VCAM1介导了白细胞在内皮细胞上的粘附,有研究已经证实,内皮细胞是通过表达mi R-126,而抑制VCAM1的表达,进而调控了血管炎症反应。还有研究探讨了miR-126对血视网膜屏障完整性的调控作用,通过作用于VCAM1和Bcl2样蛋白11起到抑制视网膜内皮细胞凋亡、减轻视网膜血管渗漏和视网膜渗透性的作用。PIK3R2是PI3K p85亚基家族的成员,能抑制PI3K/Akt途径的活化,进而调节细胞增殖、存活、侵袭、转移和血管生成等过程。PIK3R2是miR-126的靶点,miR-126-3p通过下调PIK3R2的表达来促进脊髓损伤大鼠的血管生成并抑制炎症反应。VEGF和Ang-1在血管生成过程中发挥重要的作用。VEGF结合其受体VEGFR2,而Ang-1通过结合Tie-2,促进内皮细胞存活、增殖和迁移的能力。PI3K/Akt在细胞的增殖、存活和迁移过程中发挥重要作用。此外,我们前期的研究已经发现,与健康对照组相比,ICH患者血清中miR-126的表达水平显著下调,而且和血肿周围水肿(relative perihematomal edema,rPHE)严重程度负相关。近年来,miR-126保持血管完整性和内皮细胞屏障功能的作用已被证实,但是在ICH中miR-126-3p的作用还未见报道。虽然在前期实验中,我们已经发现了miR-126和血肿周围水肿的负相关关系,miR-126是否直接参与ICH后如水肿和神经元损伤之类的并发症的发展还不清楚。综上,本研究通过向胶原酶诱导的ICH大鼠脑室中注入miR-126-3p mimic,以及体外敲除miR-126-3p,检测靶基因VCAM1和PIK3R2的表达水平和其对细胞凋亡的影响,旨在评估miR-126-3p对ICH潜在的治疗作用并探索其作用的相关机制。方法:1.动物实验:将健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠(96只,体重250-280g),按随机数字表法随机分为4组:(1)Sham组(n=24);(2)ICH组(n=24);(3)ICH+mi R-NC组(n=24);(4)ICH+miR-126-3p组(n=24)。根据Rosenberg的技术建立ICH大鼠模型,向ICH组、ICH+miR-NC组和ICH+miR-126-3p组大鼠的右侧基底节注射VII型细菌胶原酶(深度骨表面向下6mm,0.5U溶于2μl盐水,速度0.4μl/分,5min泵入)。Sham组动物采用相同方法在相同部位注入等体积的生理盐水。输注胶原酶24小时后,手术解剖大鼠脑部组织,如输注胶原酶大鼠的脑组织血肿体积几乎大小相同,同时血肿均未破入其脑室,则说明ICH大鼠模型建立成功,而且具有良好的重复性。ICH+miR-NC和ICH+miR-126-3p组大鼠成模后,再分别向右侧脑室注入转染混合液:mi R-NC(溶于5μl混合物中)和10μM miR-126-3p mimic(深度颅骨表面以下4.5mm,速度0.5μl/分)。Sham组和ICH组以同样方法在相同部位给予等体积的体内转染试剂。采用肢体放置实验和转角实验评估动物神经功能缺损情况。血脑屏障(BBB)渗透性采用伊万斯蓝染色方法测定,脑水肿程度通过测量脑含水量评估。通过实时定量PCR检测miR-126-3p水平,血管细胞粘附分子1(VCAM1)、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基2(PIK3R2)、p-Akt和Akt水平采用Western blotting法检测。脑组织切片进行免疫荧光、免疫组织化学、Fluoro-Jade B(FJB)和TUNEL染色。2.细胞实验:分离原代大鼠脑微血管内皮细胞并采用细胞爬片免疫荧光染色方法鉴定,BMEC鉴定成功后,随机分3组:(1)Control组;(2)Anti-miR-NC组;(3)Anti-miR-126-3p组。通过体外转染试剂分别将anti-mi R-126-3p(100pmol)和anti-miR-NC(100pmol)引入Anti-miR-126-3p组和Anti-miR-NC组细胞。24h后收集细胞,进行实时荧光定量PCR,检测3组细胞的miR-126-3p水平。采用单层细胞渗透实验评估BMEC单层细胞膜渗透性,流式细胞技术检测血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素1(Ang-1)处理后细胞凋亡率。结果:1.动物实验:(1)MiR-126-3p mimic脑室内给药成功转染,逆转了ICH后血肿周围区和血肿区miR-126-3p水平降低,成功显著缓解ICH后24h大鼠的行为缺损,同时,还能减轻ICH导致的BBB渗透性增高和脑水肿。(2)MiR-126-3p mimic治疗能降低血肿周围髓过氧化物酶(MPO)阳性,OX42阳性,FJB阳性、TUNEL阳性和NEUN/TUNEL双阳性细胞数,证明miR-126-3p抑制出血后中性粒细胞浸润、小胶质细胞激活和神经元凋亡。(3)MiR-126-3p mimic能抑制PIK3R2和VCAM1表达的上调,维持Akt的活化。2.细胞实验:体外分离得到了BMEC,anti-miR-126-3p转染能有效降低BMEC内miR-126-3p表达水平。体外实验证实了,敲除miR-126-3p后大鼠BMEC中PIK3R2和VCAM1表达上调、BMEC细胞屏障膜渗透性受损、抑制VEGF和Ang-1导致的的Akt活化还能使BMEC凋亡率升高。结论:实验结果证明miR-126-3p对ICH存在潜在的治疗作用,内源性miR-126-3p可能通过在脑血管内皮中靶向结合PIK3R2作用于Akt信号通路,和靶向抑制VCAM1,减轻ICH后BBB破坏、脑水肿、神经元损伤和神经功能缺损。