本研究以结直肠癌临床组织样本及邻近正常组织样本、结直肠癌细胞系及正常结肠粘膜上皮细胞为实验材料,运用分子生物学、细胞生物学和生物化学实验研究方法与技术,探究NCAPD2(染色体凝缩蛋白复合物I的亚基)在结直肠癌细胞中扮演的重要角色及其促进结直肠癌细胞生长、抑制细胞自噬的分子机制。一、NCAPD2在结直肠癌组织和结直肠癌细胞中高表达采用转录组测序分析、免疫组织化学染色、qRT-PCR、Western blot检测结直肠癌组织及邻近正常组织中NCAPD2的表达情况。结果显示:与邻近正常组织相比,NCAPD2在结直肠癌组织中明显高表达。同时,在结直肠癌细胞系中,NCAPD2的表达比正常结肠粘膜上皮细胞高。提示:NCAPD2在结直肠癌发生发展过程中可能扮演重要角色。二、NCAPD2加快细胞周期进程,促进结直肠癌细胞生长在HCT116、SW480细胞中分别转染NCAPD2质粒和NCAPD2 siRNA,采用EdU标记染色、平板克隆形成实验、流式细胞术分析、western blot检测等方法评估NCAPD2对细胞生长及增殖的影响。结果显示:与对照组相比,过表达NCAPD2后,细胞中EdU阳性细胞比例增多,形成的细胞克隆大小和数目增加;细胞周期相关基因CCND1、CCNE1表达升高,P27表达降低。而敲低NCAPD2后则呈现相反的结果。同时,敲低NCAPD2诱导细胞凋亡。提示:NCAPD2能加快细胞周期转变进而促进结直肠癌细胞生长和增殖。三、NCAPD2激活mTORC1,促进结直肠癌细胞生长在HCT116、SW480细胞中分别转染NCAPD2质粒和NCAPD2 siRNA后,采用western blot技术检测mTOR及其下游相关分子蛋白水平变化,结果显示:过表达NCAPD2后,p-mTOR(S2448)、p-p70S6K(T389/412)、p-4E-BP1(T70)的水平均增加;而敲低NCAPD2后则呈现相反的结果。在细胞转染24h后,使用3nM雷帕霉素继续处理细胞24h,敲低NCAPD2能进一步增强雷帕霉素引起的pp70S6K(T389/412)水平降低。提示:NCAPD2能激活mTORC1,促进结直肠癌细胞生长。四、NCAPD2激活mTORC1,抑制结直肠癌细胞自噬、阻断自噬流在HCT116、SW480细胞中分别转染NCAPD2质粒和NCAPD2 siRNA,采用western blot检测mTOR及自噬相关基因表达、免疫荧光分析LC3、P62表达情况并评估NCAPD2对细胞自噬和自噬流的影响。结果显示:过表达NCAPD2后p-mTOR(S2448)水平增加,Beclin1、ATG5、LC3II表达下降,P62表达增加;而敲低NCAPD2后则呈现相反的结果。提示:结直肠癌细胞中,NCAPD2激活mTORC1,抑制细胞自噬,阻断自噬流。总结:本研究结果表明NCAPD2在结直肠癌组织及细胞系中高表达;NCAPD2通过激活mTORC1,加快细胞周期转变,抑制细胞自噬和阻断自噬流,进而促进结直肠癌细胞生长和增殖。