沃尔巴克氏体（Wolbachia）是一种胞内共生菌,能够对昆虫宿主产生多种影响,其中包括细胞质不亲和现象CI（cytoplasmic incompatibility）,即感染Wolbachia的雄性和未感染Wolbachia的雌性或者感染不同品系的雌性交配,后代胚胎致死,不能进行正常发育。近年来CI现象一直是研究热点。但是关于CI的分子机制,还不是很清楚。已有研究发现,共生细菌可以利用宿主的非编码小RNA来调控宿主的许多生物学过程。因此,我们探究Wolbachia感染黑腹果蝇后能否通过微小RNA（miRNA）的作用途径,诱导果蝇宿主产生CI。本研究首先对Wolbachia感染和未感染果蝇精巢进行小RNA测序,鉴定出18种新miRNAs,其中nov-miR-6～nov-miR-18仅在感染Wolbachia果蝇精巢中特异表达,nov-miR-2仅在未感染Wolbachia果蝇精巢中特异表达。此外,我们发现10种miRNAs表达水平在宿主感染后发生显著差异改变。与对照组相比,在感染Wolbachia果蝇精巢中,有 4 种 miRNAs（nov-miR-12、dme-miR-986-3p、dme-miR-283-3p、dme-miR-306-3p）显著上调,6 种 miRNAs（dme-miR-992-5p、dme-miR-1009-3p、dme-miR-972-5p、dme-miR-137-3p、dme-miR-34-3p、dme-miR-2a-2-5p）显著下调,接着通过qRT-PCR检测验证了以上结果。其中,nov-miR-12在感染Wolbachia果蝇精巢中发生了极其显著地上调表达,差异倍数最高。首先,为了揭示差异性表达miRNAs的功能,本研究通过MiRanda、TargetScan和Mireap等软件预测差异性表达miRNAs以及特异表达的nov-miRNAs的靶标基因,共预测靶标基因10738个,并对靶标基因进行了功能富集分析,这些靶标基因主要涉及到细胞增殖与分化、生物调控、代谢、发育、生殖等方面。本课题组前期研究发现,在感染Wolbachia果蝇精巢中与精子发生相关的大部分基因下调表达,有可能影响雄果蝇育性。也有一些研究表明Wolbachia能够改变宿主miRNA表达水平,并调控其靶标基因的表达,进而为共生菌自身营造一个充足的生存条件,从而影响宿主生殖力。因此,我们选择表达差异倍数最高的novel-mir-12作为进一步研究对象。研究发现,psq（pipsqueak）是nov-miR-12预测的靶标基因之一,nov-miR-12种子序列与psq 3’UTR互补配对,通过qRT-PCR检测,与未感染精巢相比,感染Wolbachia果蝇精巢中的nov-miR-12表达水平极显著升高,psq基因表达极显著降低,推测nov-miR-12有可能负调控psq转录水平。其次,为了进一步确认nov-miR-12对psq的调控关系,本研究中包括两种体外细胞实验。一方面,通过将nov-miR-12mimic/inhibitor转染果蝇S2细胞,48h后检测psq表达水平。结果发现,nov-miR-12 mimic转染细胞后,psq表达水平显著降低,而当nov-miR-12 inhibitor转染细胞后,psq表达水平显著升高;另一方面,本研究通过构建三种双荧光素酶报告系统（空载UTR NC、完整靶标序列UTR、突变4bp 靶标序列UTR mut）,并将它们分别与nov-miR-12 mimic/NC共转染果蝇S2细胞,于48h后检测荧光素酶的活性。结果表明,只有当nov-miR-12 mimic和完整psq UTR序列共同存在时,荧光素酶活性会出现显著降低,而当转染UTR突变体后,荧光素酶活性没有明显改变,这就进一步证实了 nov-miR-12确实能够在体内通过与靶标基因psq 3’UTR结合,抑制其表达。接着,为了深入研究psq在果蝇体内的功能,本研究对果蝇进行psq的生殖腺特异敲降,之后检测敲降雄蝇后代胚胎孵化率。结果显示,与对照组相比,psq敲降雄蝇与未感染雌蝇交配后,后代孵化率显著降低。通过对后代的早期胚胎进行DAPI染色发现,psq敲降后的雄蝇后代在早期胚胎发育过程中出现核分裂不同步,核凝集成簇,以及染色质桥现象。综合以上结果,我们推断,Wolbachia可能通过调控miRNA与其靶标基因之间的作用途径,改变与生殖相关的重要基因表达水平,进而使昆虫宿主产生细胞质不亲和（CI）的表型。本研究可为探讨共生菌和其昆虫宿主之间的复杂关系,尤其是Wolbachia感染产生的CI机制,提供一定的理论依据与新思路。