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研究目的:
骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨变性、破坏，关节滑膜炎以及骨质增生为主要病理特征的常见风湿性疾病。长期以来对OA的研究主要集中于关节软骨和软骨细胞，但是越来越多的证据已表明，滑膜的炎症反应在有症状的OA患者中普遍存在，而且与临床表现出的症状相关。有关研究发现，Notch信号途径不仅参与胚胎的发育，也参与了多种疾病的发生与发展。目前该信号途径与类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)等炎症性自身免疫性疾病的关系已受到越来越多人的重视。本研究的目的:建立滑膜细胞原代培养方法并比较正常人与OA患者成纤维样滑膜细胞Notch受体在mRNA水平表达的差异。并进一步证实Notch信号在调节滑膜细胞分泌细胞因子及基质金属蛋白酶中所发挥的作用。通过本研究可望进一步明确OA的发病机制，并为发展基于干预Notch信号的免疫治疗提供理论依据。
研究方法:
(1)通过组织块培养法进行滑膜细胞原代培养，原代细胞传至3-5代，采用流式细胞术(FCM)检测成纤维样滑膜细胞(FLS)的纯度。
(2)采用荧光定量PCR比较正常人与OA患者FLS的Notch受体mRNA水平表达，并以LPS(10ng/ml)或LPS(10ng/ml)+DAPT(5μmol)刺激OA患者FLS，通过荧光定量PCR和Western-blot方法检测Notch受体及其下游靶基因在mRNA及蛋白水平的表达。分析炎性刺激或DAPT非特异性阻断对OAFLSNotch受体的影响。
(3)荧光定量PCR分析上述处理组OAFLS细胞因子IL-6，IL-8及基质金属蛋白酶mRNA水平的表达。采用流式芯片技术检测上述处理组细胞培养上清中细胞因子的表达，探讨Notch信号途径对OAFLS细胞因子及基质金属蛋白酶以及其分泌的细胞因子的影响。
研究结果:
(1)组织块培养法原代培养的FLS传至第3代时可呈现典型的梭形形态;FCM检测到CD90在FLS上的表达率可达96.73％。
(2)Notch4受体在正常人或OA患者FLS表达均较低，但OA患者滑膜细胞Notch受体1、2、3以及Hes-1mRNA表达水平明显高于正常人（P＜0.05）。提示OAFLSNotch信号活化程度高于正常人，且经γ-分泌酶抑制剂(DAPT)非特异性阻断后，与对照组相比Notch受体1、2、3以及Hes-1mRNA表达明显下降。
(3)OAFLS可产生细胞因子IL-6和IL-8。同时，滑膜细胞也表达基质金属蛋白酶尤其以MMP3和MMP9为主。而经LPS刺激以后，Notch信号明显活化同时，上述细胞因子与基质金属蛋白酶的表达也明显增高(P＜0.05);流式芯片检测细胞培养上清结果显示，与对照组相比，炎性刺激可诱导OAFLS分泌大量的细胞因子，而DAPT非特异性阻断Notch信号后OAFLS培养上清中细胞因子的含量降低（P＜0.05）。
结论:
(1)采用滑膜组织组织块贴壁培养法可成功构建骨性关节炎成纤维样滑膜细胞的体外培养模型。
(2)OAFLSNotch受体及下游靶基因Hes-1mRNA水平表达较正常人FLS高，经DAPT处理后Notch信号活化受到明显抑制。提示OA患者滑膜细胞Notch信号可能存在异常活化。
(3)LPS刺激可诱导OAFLSIL-6，IL-8等炎性因子和基质金属蛋白酶的表达增高，而DAPT处理后滑膜细胞中基质金属蛋白酶和细胞培养上清中细胞因子IL-6的表达明显降低，提示Notch信号途径在骨性关节炎患者关节局部炎性机制中可能发挥重要作用。