目的乳腺叶状肿瘤(PTs)是少见的乳腺纤维上皮性肿瘤,约占所有乳腺肿瘤的1%,在乳腺的纤维上皮性肿瘤中的比例大致为2%-3%。乳腺叶状肿瘤的特点是间质的弥漫性显著增生,这种肿瘤间质改变被认为是叶状肿瘤关键的诊断要素。1982年,世界卫生组织提出建议将乳腺叶状肿瘤按照其组织学连续性分为三种等级:良性、交界性及恶性。外科手术是乳腺叶状肿瘤的基本治疗手段,但是采用局部肿物切除术还是乳房全切术还尚未统一。我们在临床病理诊断工作中发现,随着叶状肿瘤等级升高,上皮成分明显减少,我们推断上皮-间质转化(EMT)可能在叶状肿瘤的等级发展过程中起作用。恶性叶状肿瘤常伴有异源性化生成分,这些异源性化生成分通常与软骨肉瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤以及纤维肉瘤等间叶组织来源恶性肿瘤相似,我们因此认为这些经历EMT转化而来的细胞具有了间质肿瘤干(样)细胞(MSCs)特性。本研究旨在探讨上皮-间质转化(EMT)在乳腺叶状肿瘤发生发展中的作用及间质肿瘤干(样)细胞(MSCs)在恶性叶状肿瘤中表达情况。方法收集天津医科大学肿瘤医院1987年4月至2010年6月经手术切除病理证实的乳腺叶状肿瘤246例。排除标准包括上皮性恶性肿瘤,接受过新辅助化疗的病例及失访病例。按照标准外科学指南,所有病人接受了手术治疗(局部切除术/保乳手术/全乳腺切除术/乳腺改良根治术),部分病人术后予以辅助放疗及化疗。所有手术切除样本均完全取材,并在4%中性福尔马林中固定进而进行石蜡包埋处理。组织切片常规进行伊红苏木素染色。所有病例均由两名副高级以上病理医师确诊。有关年龄,月经状态,肿瘤类型,肿瘤大小,淋巴结转移及乳腺癌家族史等由查阅我院存档的临床病历资料得来。根据世界卫生组织对乳腺肿瘤的分类,当叶状肿瘤中同时出现间质细胞核多形性、间质过度生长从而使一个低倍视野下不能检出上皮成分仅存在间质成分、核分裂象增多(≥10/10HPF)、间质细胞过度弥漫性生长以及肿瘤浸润性边界应诊断为恶性叶状肿瘤。当叶状肿瘤中出现恶性异源性成分时,即使不同时出现以上情况也可诊断为恶性叶状肿瘤。分析患者年龄、肿瘤大小、近期快速增长史、疼痛、手术方式在不同等级叶状肿瘤之间的相关关系。运用单因素分析和多因素分析探讨与叶状肿瘤局部复发和远处转移有关的临床病理学特征。运用单因素生存分析以及多因素生存分析,分析患者年龄、肿瘤大小、近期快速增长史、疼痛、叶状肿瘤等级以及手术方式对无复发转移生存以及总生存率的影响。本研究依据病案资料随机抽取乳腺叶状肿瘤石蜡组织样本246例,其中良性104例、交界性109例及恶性33例。采用免疫组织化学及免疫荧光化学研究方法对EMT及MSCs相关分子标记在乳腺叶状肿瘤中的表达状态进行检测,结合患者临床病理资料分析EMT及MSCs与各等级叶状肿瘤的相关性,以及各指标对患者预后的影响。模拟乳腺叶状肿瘤生存环境,建立共培养体系,纤维肉瘤(HT1080)与乳腺正常上皮细胞(MCF-10A)共同培养,通过形态学观察、细胞骨架测定、免疫荧光、Western blot及RT-PCR等手段检测相关EMT分子标记的变化情况。结果叶状肿瘤临床病理特征总结分析显示,病人年龄、肿物最大径、病人绝经状态、近期增长病史及疼痛病史在良性、交界性及恶性叶状肿瘤间差异没有统计学意义(P=0.074,P=0.345,P=0.903,P=0.706以及P=0.346)。叶状肿瘤手术方式统计结果显示,手术方式(保乳术、肿物切除术、全乳腺切除术及改良/根治术)在良性、交界性及恶性叶状肿瘤中差异存在统计学意义(P<0.001)。评估246例乳腺叶状肿瘤上皮及间质成分的EMT分子标记情况,统计结果显示,E-cadherin(P=0.025)、Snail(P=0.001)、Slug(P<0.001)及Twist(P=0.044)在上皮细胞表达随叶状肿瘤等级升高的表达差异具有统计学意义。对于间质细胞表达情况,Snail(P=0.007)及Slug(P=0.001)在良性、交界性及恶性叶状肿瘤间差异存在统计学意义。探讨伴异源性化生的乳腺恶性叶状肿瘤相关上皮间质转化(EMT)与间质肿瘤干细胞(MSCs)共表达情况,研究发现MSCs标记(GD2和ALDH1)与EMT标记物(Slug和Twist)在这些病例中共同表达。叶状肿瘤患者预后生存分析显示,至随访截止,45例(18.3%)有局部复发和远处转移,25例(10.2%)死亡。统计结果表明,复发部位多为胸壁,肿瘤转移多发生在肺部、肝脏和脑组织。恶性叶状肿瘤中有12例(12/33,36.4%)发生局部复发和远处转移,相比交界性叶状肿瘤21例(21/109,19.3%)及良性叶状肿瘤12例(12/104,11.5%)之间的差异具有统计学意义(P=0.005)。同样地,三种等级叶性肿瘤的总体生存率(OS)之间的差异也存在统计学意义(P<0.001)。所有随访病例的5年无复发转移生存率(5-DFS)为82.9%,5年总体生存率(5-OS)为92.3%。其中,良性叶状肿瘤组(97.1%)的5-OS相比于交界性组(96.3%)及恶性组(78.8%)之间的差异存在统计学意义(P<0.001)。对于5-DFS,良性、交界性及恶性叶状肿瘤之间的差异也存在统计学意义(P=0.001)。单变量分析显示,叶状肿瘤等级(P=0.001)、Slug过表达(P=0.036)及手术方式(P<0.001)是影响患者无复发转移生存率的主要因素。COX多因素分析显示,手术方式(P=0.009)是影响无复发转移生存率的独立预后因素。同样地,叶状肿瘤等级(P<0.001)、近期增长病史(P=0.007)、Slug过表达(P=0.028)及手术方式(P=0.002)是影响患者总体生存率的主要因素,其中,近期增长病史(P=0.003)及叶状肿瘤等级(P=0.001)是影响总体生存率的独立预后因素。模仿乳腺叶状肿瘤体内生长环境,建立了时间梯度共培养模型并验证人纤维肉瘤细胞系(HT1080)条件培养基诱导乳腺正常上皮细胞系(MCF-10A)发生形态学改变,实验结果显示,随着共培养时间延长,与HT1080条件培养基共同培养的MCF-10A细胞系形态学发生了改变,细胞由鹅卵石上皮样形态变成梭形纺锤样形态,并且通过鬼笔环肽标记的F-actin细胞骨架蛋白染色也发现,乳腺正常上皮的细胞骨架发生重塑,细胞内肌动蛋白及微丝微管蛋白由稀疏变得致密,荧光发光大大增强。且通过Western blot及RT-PCR方法验证了共培养后MCF-10A相关EMT信号的变化。Western blot实验结果发现,与HT1080条件培养基共培养后的MCF-10A细胞系E-cadherin蛋白表达水平下降,N-cadherin、Snail、Slug及Twist蛋白水平随共培养时间增加而升高。经RT-PCR结果发现,共培养后MCF-10A细胞相关EMT mRNA水平发生改变。通过经共培养后细胞形态学发生的变化及细胞内EMT蛋白及相关mRNA含量的变化,我们认为这些共培养后MCF-10A细胞发生EMT后,并执行相应的生物学功能。结论叶状肿瘤临床病理特征总结分析显示,手术方式(保乳术、肿物切除术、全乳腺切除术及改良/根治术)在良性、交界性及恶性叶状肿瘤中差异存在统计学意义,而病人年龄、肿物最大径、病人绝经状态、近期增长病史及疼痛病史在良性、交界性及恶性叶状肿瘤间差异没有统计学意义。乳腺叶状肿瘤上皮及间质成分的EMT分子标记情况,统计结果显示,E-cadherin、Snail、Slug及Twist在上皮细胞表达随叶状肿瘤等级升高的差异具有统计学意义。对于间质细胞表达情况,Snail及Slug在良性、交界性及恶性叶状肿瘤间差异存在统计学意义。并且研究发现MSCs标记(GD2和ALDH1)与EMT标记物(Slug和Twist)在恶性叶状肿瘤中共同表达。叶状肿瘤患者预后生存分析显示,三种等级叶状肿瘤在OS、DFS以及5-OS、5-DFS之间的差异存在统计学意义。单变量分析显示,叶状肿瘤等级、Slug过表达及手术方式是影响患者无复发转移生存率的主要因素。COX多因素分析显示,只有手术方式是影响无复发转移生存率的独立预后因素。同样地,叶状肿瘤等级、近期增长病史、Slug过表达及手术方式是影响患者总体生存率的主要因素,其中,近期增长病史及叶状肿瘤等级是影响总体生存率的独立预后因素。细胞功能学实验表明,随着共培养时间延长,与HT1080条件培养基共同培养的MCF-10A细胞系形态学发生了改变,细胞由鹅卵石上皮样形态变成梭形纺锤样形态,并且通过鬼笔环肽标记的F-actin细胞骨架蛋白染色也发现,乳腺正常上皮的细胞骨架发生重塑。通过Western blot及RT-PCR方法验证了共培养后MCF-10A细胞系E-cadherin蛋白表达水平下降,N-cadherin、Snail、Slug及Twist蛋白水平随共培养时间增加而升高。经RT-PCR结果发现,共培养后MCF-10A细胞相关EMT mRNA水平发生改变。通过经共培养后细胞形态学发生的变化及细胞内EMT蛋白及相关m RNA含量的变化,我们认为这些共培养后MCF-10A细胞发生EMT后,并执行相应的生物学功能。本研究认为,乳腺叶状肿瘤具有异质性,与其他乳腺恶性肿瘤相比,是相对较温和的乳腺肿瘤,并且预后相对较好。针对EMT通路的靶向治疗以及EMT和MSCs基因表达水平变化值得我们进一步研究。