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目的:1.本文通过对“肾”、“精”、“髓”、“骨”、“关节软骨”的概念、功能及内涵的阐释,探讨“肾-精-髓-骨-关节软骨”的系统联系,以及“肾虚-精亏-髓减-骨枯-关节软骨退变”的病理影响,并提出假说“中医肾对关节软骨有调控作用”。2.观察软骨细胞内敲除BMP2、BMP4基因对小鼠关节软骨组织形态的影响。3.基于BMP2/BMP4信号通路,探究关节软骨代谢过程中,影响其自身形态稳定性及退行性病变的分子机制。4.观察补肾中药淫羊藿有效成分单体淫羊藿苷、补骨脂有效成分单体补骨脂素、女贞子有效成分单体齐墩果酸、何首乌有效成分单体二苯乙烯苷对骨髓间充质细胞成骨分化过程中BMP2、BMP4基因及蛋白表达的影响。5.探讨补肾中药对关节软骨自身维护的作用,分析临床使用补肾的方法治疗关节退行性病变的分子机制,进而阐释探讨中医肾与关节软骨的关系,以丰富“肾主骨”理论的科学内涵。材料与方法:理论研究:从阴阳及五行属性,分析“肾”的医学含义,解释其生理功能及病理规律;分析“精”、“髓”的哲学含义和医学含义,解释其生理功能和病理规律;汇总古代文献中对“骨”的解剖术语及释义;解析“关节软骨”的概念、功能及内涵;分析肾、精、髓、骨、关节软骨之间生理以及病理联系。总结并诠释“肾”、“精”、“髓”、“骨”、“关节软骨”的概念、功能及内涵,探讨“肾-精-髓-骨-关节软骨”的在生理功能方面的系统联系,以及在病理情况下“肾虚-精亏-髓减-骨枯-关节软骨退变”的病理影响。提出假说:中医肾对关节软骨有调控作用。体内实验:实验动物及分组:使用他莫西芬诱导II型胶原特异性表达组织靶向Cre剪切酶转基因工具小鼠(col2a1-creertm)与bmp2、bmp4基因flox标定小鼠(bmp2fx/fx;bmp4fx/fx),配得软骨细胞内bmp2/bmp4基因敲除小鼠(bmp2/bmp4)col2a1-creer。(bmp2/bmp4)col2a1-creer小鼠出生后2周,腹腔注射他莫西芬(1mg/10g体重,日一次,连续5天),同窝小鼠以cre表达阳性与阴性分为两组,(bmp2,bmp4)col2er和control组,每组6-8只,雌雄随机,分别观察3、6月龄小鼠后肢膝关节关节软骨变化。实验方法:取3、6月龄小鼠右侧后肢膝关节,固定、脱钙、石蜡包埋并切片(3um)。阿尔新蓝染色后,封片,镜下观察并拍照,观察膝关节组织形态学改变;使用骨计量学软件,测量关节软骨(胫骨端及股骨端之和)面积,并作统计分析。另取石蜡切片,用免疫组化法检测关节软骨区mmp13、adamts4、adamts5蛋白表达,镜下观察并拍摄照片;使用骨计量学软件,计数关节软骨内mmp13、adamts4、adamts5蛋白表达阳性的软骨细胞,并作统计分析。体外实验:细胞分离及培养:1月龄野生型小鼠(c57/bl6),取双侧后肢骨,分离间充质细胞(p0),传代扩增后(p1),按相同浓度铺置于细胞培养板中,分为淫羊藿苷组、补骨脂素组、齐墩果酸组和二苯乙烯苷组每组,与对照组相比较,观察其各自对间充质细胞成骨方向转化的影响,并检测相关基因和蛋白表达的变化。实验方法:分离出的间充质细胞(p0),经传代扩增后(p1),按相同浓度铺置于细胞培养板中,安组别(每组3个复孔)分别给予淫羊藿有效成分单体淫羊藿苷、补骨脂有效成分单体补骨脂素、女贞子有效成分单体齐墩果酸、何首乌有效成分单体二苯乙烯苷(浓度均为1×10-7mol/l)不同药物进行干预。48小时,收集细胞,提取rna,实时定量pcr法检测bmp2、bmp4、runx2、alp基因表达;第5天,收集细胞,提取蛋白,western-blotting法检测runx2、bmp2、bmp4蛋白表达含量;第7天,细胞冲洗、固定,alp染色,观察alp活性,并拍照比较。结果:1.关节软骨属于中医“骨”的范畴,其发育和自身维护与“肾-精-髓-骨-关节软骨”系统的功能和联系密切相关。关节软骨的退行性病变责之于肾虚精亏、髓减骨枯,故其治疗当从肾论治。2.(bmp2,bmp4)col2er组小鼠3月龄、6月龄均出现关节软骨形态改变:①股骨端和胫骨端两侧关节软骨表面仍完整延续,但整体出现变薄、退化的现象;②蓝色软骨区域颜色变浅,提示关节软骨与长骨端的嵌合度下降;③软骨下骨增生。提示有关节软骨退行性病变。骨计量学结果显示3月龄、6月龄(bmp2,bmp4)col2er组小鼠关节软骨面积均较control组明显减少(p<0.05)。3.(bmp2,bmp4)col2er组3月龄、6月龄小鼠关节软骨表层软骨区域mmp13表达明显强于control组;②而中层、深层软骨区,未见明显差异。骨计量学结果:(bmp2,bmp4)col2er组3月龄小鼠关节软骨表层区域mmp13表达阳性细胞数均数与control组相比较,明显增多(p<0.05);(bmp2,bmp4)col2er组6月龄小鼠关节软骨面积均数较control组增多,但无统计学意义。4.(bmp2,bmp4)col2er组3月龄、6月龄小鼠关节软骨表层软骨区域adamts5蛋白表达明显强于control组;②而中层、深层软骨区,未见明显差异。骨计量学结果:(bmp2,bmp4)col2er组3月龄、6月龄小鼠关节软骨表层区域adamts5蛋白表达阳性细胞数均数与control组相比较,均显示明显增多(p<0.05)。5.(bmp2,bmp4)col2er组3月龄、6月龄小鼠关节软骨表层软骨区域(superfacialzone)adamts4蛋白表达明显强于control组;②而中层、深层软骨区,未见明显差异。骨计量学结果:(bmp2,bmp4)col2er组3月龄、6月龄小鼠关节软骨表层区域adamts4蛋白表达阳性细胞数均数与control组相比较,均显示明显增多(p<0.05)。6.淫羊藿有效成分单体淫羊藿苷、补骨脂有效成分单体补骨脂素、女贞子有效成分单体齐墩果酸、何首乌有效成分单体二苯乙烯苷促进骨髓间充质细胞成骨方向分化。7.淫羊藿有效成分单体淫羊藿苷、补骨脂有效成分单体补骨脂素、女贞子有效成分单体齐墩果酸、何首乌有效成分单体二苯乙烯苷促进骨髓间充质细胞bmp2、bmp4、runx2、alp基因表达(p<0.05)。8.淫羊藿有效成分单体淫羊藿苷、补骨脂有效成分单体补骨脂素、女贞子有效成分单体齐墩果酸、何首乌有效成分单体二苯乙烯苷促进骨髓间充质细胞bmp2、bmp4、runx2、alp蛋白表达。结论:1.诠释肾、精、髓、骨、关节软骨的含义,解析“肾藏精-生髓-主骨-关节软骨”的系统联系和“肾虚-精亏-髓减-骨枯-关节软骨退变”的病理变化。2.关节软骨化生于肾中所藏先天之精,依赖肾主水液的滋润和濡养,因此中医肾对关节软骨有调节作用。3.BMP2、BMP4基因在软骨细胞内敲除后,导致关节软骨退变的形态学变化,引起OA相关蛋白MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5表达增高,说明BMP2、BMP4对关节软骨维持自身形态稳定有正向的调节作用。4.补肾中药淫羊藿有效成分单体淫羊藿苷、补骨脂有效成分单体补骨脂素、女贞子有效成分单体齐墩果酸、何首乌有效成分单体二苯乙烯苷能够使间充质细胞BMP2、BMP4基因及蛋白水平表达升高,可能是补肾中药防治关节软骨退变、维持关节软骨形态稳定的机制。5.“肾主骨”理论包含肾中精气对关节软骨代谢的主宰作用,肾与关节软骨的系统联系值得进一步深入研究和探讨。