阻断内皮素A受体对食管鳞癌细胞侵袭力的影响

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背景:食管癌是当前世界范围内一种常见的消化道恶性肿瘤,其病理分型主要为腺癌和鳞状细胞癌。作为一种高度恶性的肿瘤,食管癌的预后不太理想,5年生存率仅为30%~50%。影响预后的主要因素是术后淋巴结的复发转移。中国是世界食管癌高发的国家,其食管癌类型与西方国家有很大的不同,与西方国家食管腺癌高发的特点不同,中国食管鳞状细胞癌(ESCC)约占食管癌患病总数的90%。所以对食管鳞癌的研究对中国食管癌的防治具有特别重大的意义。内皮素—1(ET-1)是由21个氨基酸多肽组成的内皮素家族的3个成员之一,是目前所知作用最强的血管收缩物质,参与了高血压、心脏衰竭、肺动脉高压等疾病的发生发展。最近的研究表明,卵巢癌,前列腺癌,肺癌和结肠癌等癌症中,均有ET-1及其受体ETAR/ETBR的异常表达,ET-1轴在癌变中的作用也逐渐被揭示如下①调节细胞间信号的传递,促进原癌基因转录、应答。②促进肿瘤细胞的增殖,起到内生性生长促进剂的作用。③促进肿瘤血管的生成。④促进肿瘤细胞侵袭,有利于肿瘤细胞的侵袭和转移。⑤调节细胞黏附。⑥抑制肿瘤细胞的凋亡尽管ET-1轴的过度活化在癌症中已经被证实,但据我们所知,有关食管鳞癌中ET-1表达及其功能的报道却很少。目的:通过检测ET-1在食管鳞状细胞癌(ESCC)的表达;与snail、E-cadherin表达的关系;沉默ET-1表达后ESCC细胞在体内与体外功能的改变以及ET-1受体抑制剂-波生坦对ESCC细胞的影响等多方面,全面探讨ET-1在细胞增殖,转移和侵袭中的作用。方法:1、选取于2006年1月~2009年6月在山东大学附属省医院做食管癌根治术的食管癌患者119名。其中男89人,女30人,年龄范围42—70岁。纳入标准:(1)胸中段食管鳞状细胞癌,术后病理诊断分期Ⅰ-Ⅲ期(2)无术前化疗或放疗(3)无手术禁忌证:所有患者接受Ivor-lewis手术,完全切除:上下缘行病理检查无残余癌细胞,肉眼下侧缘无残余的癌细胞,并行二野淋巴结清扫术(共有1392个淋巴结,平均每例13.5个)。(4)至少随访满3年和第一次复发部位有明确记录(5)无严重术后并发症,TNM分期依据国际抗癌联盟(UICC)2009年发布的标准,淋巴结清扫术依据美国癌症联合委员会(AJCC)1997年发布的食管癌淋巴结测绘系统。随访:患者在前三年每3-6个月进行一次常规检查,之后每6-12个月进行一次。每次随访时要进行临床评估及胸片、颈部和腹部超声(美国)或颈部、胸部和腹部电脑断层扫描(CT)等相关检查对患者的健康状况进行分析。正电子发射断层扫描(PET),骨显像,脑CT和组织活检主要应用于特定症状的检查,疑似复发的部位要经过彻底的详细检查才能进行证实或排除。通过免疫组织化学研究119例食管癌样本中ET-1蛋白的表达及其与病人年龄、性别、体重下降程度、肿瘤的尺寸、浸润深度,分化、淋巴结转移和复发的关系。免疫组化法:组织经福尔马林固定,石蜡包埋后切成4gm的切片。将切片脱蜡,用3%的过氧化氢孵育。将特异性兔多克隆抗ET-1抗体按照1:100的比例稀释后,4℃下放置过夜。然后按照生物酰化的二抗试剂盒的使用说明操作。阴性对照组用磷酸盐缓冲盐水代替一抗,所有切片由对临床资料不了解的两位独立病理专家进行检测。比例得分和染色强度得分相乘得到免疫组织化学评分(IHS值)。IHS>4被认为是阳性。2、(1)细胞培养:人食管鳞癌细胞株KYSE150选用罗斯韦尔公园纪念研究所介质(RPMI-1640)维持单层培养,包括加热灭活的胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,放入加湿培养器中,在37℃C,5%CO2的环境下培养。(2)用携带ET-1siRNA慢病毒载体的转染构建ET-1沉默细胞系KYSE150siET-1,利用RT-PCR及Western blot检测ET-1沉默细胞系ET-1mRNA表达情况明确沉默效果,利用Western blot检测沉默ET-1后ESCC细胞snail与E-cadherin表达的变化,验证ET-1对肿瘤细胞粘附的影响,明确ET-1在肿瘤细胞转移过程中的作用。PT-PCR法:所有细胞RNA使用RNAiso Plus提取。RNA的纯度用紫外分光光度计测定,OD260/280值为1.8-2.0。实时定量RT-PCR测定使用的是LightCycler480Ⅱ实时PCR系统。循环条件如下:使用SYBR(?) Premix Ex TaqTM95℃预孵育5分钟,95℃10秒,60℃10秒,72℃10秒45个扩增循环,。PCR引物ET-1,5’-TAT GGA TGA ACT GCG TGG TG-3’(上游引物)and5’-CAC GAT GAT GCT GAT GAT GAC-3’(下游引物),大小122bp; GAPDH,5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’(上游引物)and5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCTTC-3’(下游引物),大小258bp.所有样本至少PCR两次。ET-1mRNA的表达水平通过ET-1mRNA和GAPDH mRNA的比值计算。Western blot:蛋白质在10%SDS-PAGE中被分离之后转移到硝酸纤维素膜上。用含0.05%Tween20和1%BSA的5%脱脂奶粉在室温下封闭1小时;4℃下,蛋白用抗RUNX3基因和抗p-肌动蛋白的初级抗体孵育过夜,洗涤后,纤维素膜在室温下用辣根过氧化物酶抗兔IgG标记的二抗孵育1小时。在增强化学发光检测系统下可观察到显色带。获得条带的强度通过图像分析系统测定,并以GAPDH作为内对照进行标准化。应用CCK8检测验证ET-1对ESCC细胞增殖的影响;侵袭小室实验检测ET-1对ESCC细胞迁移、侵袭力的影响。检测加入内皮素受体拮抗剂波生坦后CCK8检测与侵袭小室实验结果的变化进一步明确ET-1在ESCC细胞增殖与侵袭中的作用并探讨内皮素受体抑制剂在ESCC治疗中的应用前景。通过裸鼠实验了解ET-1在体内ESCC细胞生长、增殖、侵袭过程中的作用。CCK8检测:通过CCK8法检测KYSE150细胞和KYSE150SiET-1细胞的增殖情况。将细胞接种96孔微量滴定板中,每孔的细胞浓度相同,1×104个。分别在6,12,24,48和72小时加入10μgL CCK8(5毫摩尔/升)。测定在490nm的光密度。侵袭小室实验:采用24孔侵袭小室装置和一个8μm孔径聚碳酸酯核孔过滤器进行三重检测。每次实验前,细胞在24小时内去除FBS。在侵袭检测中,插入物要用人工基底膜进行预覆盖,所用人工基底膜在使用前要用无血清的Ham氏F10进行1:10稀释,并在37℃下孵育一个小时。迁移检测时,插入物要求是未覆盖的。每个上部孔中加入2x105个细胞和2001μ1无血清培养基。下部孔内加入600μ1含有10%FBS的1640介质。侵袭实验需要24小时,迁移实验需要6个小时。刮掉残留在插入物上表面的细胞。附着在下表面的迁移、转移细胞在甲醇中固定10分钟,并用酒精基结晶紫染色。把细胞放在显微镜下观察,在膜中间部位随机选取5个视野进行细胞计数。裸鼠实验:将裸鼠放入山东大学附属省立医院实验动物中心的无菌设备中饲养,给小鼠提供无菌食物,水和草垫。每个笼子里笼最多装5只小鼠,笼子顶部上安置12小时光/暗循环滤波器。将小鼠随机分成2组,每组6个:1.KYSE150-siNC对照作为正常对照组;2.KYSE150-siET-1作为siET-1组。在无菌条件下,将消化好的细胞在不含FBS的PBS中制成细胞重悬液,在无菌条件下注入小鼠右肩皮下,每只注射100微升含有1×106个细胞。第9天起每3天用游标卡尺测量肿瘤长径与宽径,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,细胞接种后28天断颈法处死小鼠,取出肿瘤并称重,对肿瘤的生长进行评估。肿瘤体积计算公式:肿瘤体积=长直径×短直径。结果:高水平的ET-1表达与肿瘤的侵润深度,分化,淋巴结转移和复发有关;年龄,性别,肿瘤大小不会造成显著差异。ET-1高表达的患者比ET-1低表达的患者有较低的5年生存率。用携带ET-1siRNA’慢病毒载体的转染构建ET-1沉默细胞系,荧光染色证实转染成功,RT-PCR及Western blot检测ET-1沉默细胞系ET-1mRNA及ET-1蛋白表达均明显下降,利用Western blot检测证实沉默ET-1后ESCC细胞snail表达明显下降,E-cadherin表达明显升高,ET-1可以使细胞间粘附水平下降,促进ESCC细胞的转移;CCK8检测证实沉默ET-1后ESCC细胞增殖水平下降,应用波生坦之后ESCC细胞增殖水平也明显下降。证明ET-1可以促进ESCC细胞的增殖,波生坦可以有效抑制ESCC的增殖;侵袭小室实验证实沉默ET-1之后ESCC细胞的迁移、侵袭力下降,应用波生坦以后ESCC迁移、侵袭力也明显下降。证明ET-1可以提高ESCC细胞的迁移、侵袭力,波生坦可以有效抑制ESCC的迁移、侵袭。裸鼠实验证实沉默ET-1后ESCC细胞在裸鼠体内的生长速度明显下降。讨论:ET-1在食管鳞状细胞癌的增殖、迁移、侵袭、转移等过程中起到重要作用,ET-1的过表达与食管鳞状细胞癌的高复发率和低五年生存率显著相关,它可以用来作为生物标记来预测食管鳞癌病人的预后。可以作为ET-1过度表达患者治疗的靶点。
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