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生物钟是生物为了适应24小时地球自转周期而形成的一套自主的计时系统,这一系统受转录-翻译水平的负反馈环路调控,而相关的生物钟基因及蛋白是组成这些负反馈环路的基本元件,生物钟系统控制着人类新陈代谢、进食/禁食节律等,其中睡眠-觉醒节律是受生物钟系统控制的典型例子。睡眠是几乎所有动物生命活动的基本过程,在动物中具有很强的保守性,睡眠不足严重影响人们的身心健康,但关于调控睡眠的机制,尤其是生物钟对睡眠的调控机制,尚未得到完全阐释。生物钟蛋白DEC2（Differentiated embryo-chondrocyte expressed gene 2）/BHLHe41/Sharp1 是参与生物钟负反馈环路的重要元件,并且在睡眠调节中也起到了重要的作用。在人类中,DEC2蛋白第385个氨基酸从脯氨酸突变成精氨酸（DEC2 P385R）可使突变携带者的睡眠显著减少。但是小鼠敲除模型的结果却与人的结果相反,Dec2全身敲除的小鼠在晚上的睡眠显著增多,人DEC2位点突变（DEC2 P385R）与小鼠Dec2基因敲除睡眠表型相反。因此迫切需要新的模式动物来研究Dec2在生物钟及睡眠调控中的功能。斑马鱼中发现的18029个基因中有13355个是人类的同源基因。斑马鱼是昼行性动物,和人类一样,都是夜间睡眠,斑马鱼睡眠研究的研究可以给人类睡眠研究提供重要的参考,因此斑马鱼是研究生物钟及睡眠的理想的模式生物。本研究首先探讨dec2在斑马鱼生物钟中的作用,qRT-PCR实验发现dec2在斑马鱼中节律表达,细胞转染实验发现dec2通过E-box受生物钟调控并且参与生物钟的负反馈环路。我们利用 CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术构建了全身敲除的斑马鱼dec2无义突变体,行为实验发现dec2-/-在正常光暗（light:dark=14 h:10 h,LD）、持续黑暗（DD）和持续光照（LL）条件下,活动量均发生了显著变化,但不影响运动的周期。其中,在LD条件下,dec2-/-在白天的活动量显著低于WT。通过qRT-PCR实验发现多数核心生物钟基因在dec2-/-表达量下调;但是生物钟负向调控因子per1b则在dec2-/-中上调,细胞转染实验表明Dec2通过E-box抑制per1b的表达。进一步分析发现Dec2具有LXXLL基序,LXXLL基序又称为核受体盒,可以直接绑定到核受体的C末端配体,促进下游基因的转录,通过细胞转染实验发现斑马鱼Dec2和人DEC2可以通过Rorαa显著提高受RORE元件调控的bmal1b基因的表达,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验发现Dec2可以绑定Rorαa,说明Dec2在斑马鱼生物钟中具有正向调控作用,且该功能在物种间具有保守性。综上,我们检验了斑马鱼Dec2在斑马鱼生物钟的双向调控作用,既通过E-box元件抑制生物钟基因如per1b的表达行使负向调控功能,又绑定Rorαa后通过RORE元件促进生物钟基因如bmal1b的表达,行使正向调控功能。为了解析dec2-/-在白天活动量显著下调的原因,以及进一步解析dec2在斑马鱼中其它潜在的功能,我们对dec2-/-和WT的成鱼大脑进行了深度测序。发现dec2突变后维持觉醒的食欲素前体基因hcrt在ZT0时表达量下调,促进睡眠的褪黑素的关键合成酶基因aanat2基因在ZT0时显著上调,另外,dec2突变后还影响了斑马鱼的节律进程、DNA序列特异性绑定、响应机械刺激、光传导、前脑发育、光传导、DNA甲基化或脱甲基化、PPAR信号通路、神经肽活性等方面产生了影响,说明dec2在斑马鱼正常生长发育过程中扮演着重要的作用,尤其是hcrt和aanat2是睡眠/觉醒中十分重要的两个基因,这两个基因在突变体中显著改变提示dec2-/-可能影响斑马鱼的睡眠/觉醒环路。因此我们进一步分析行为发现与WT相比,dec2-/-具有与人类2型嗜睡症中白天过度嗜睡（Excessive daytime sleepiness,EDS）相似的表型,并且dec2-/-的睡眠潜伏期显著低于WT,另外,dec2-/-对睡眠干扰不敏感。分子水平上,qRT-PCR实验验证了hcrt基因在dec2-/-表达量在白天显著下调,aanat2在dec2-/-中表达量显著上调。ELISA实验发现Hcrt在斑马鱼突变体中表达下调,Melatonin在dec2-/-中的含量在白天上调。以上结果提示在斑马鱼中,Dec2可能激活hcrt表达,进一步分析发现hcrt基因的启动子具有RORE元件,细胞转染实验发现斑马鱼Dec2可以促进hcrt的表达,通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验发现Rorαa可以与hcrt启动子的RORE元件绑定,细胞转染实验发现Dec2可以显著抑制aanat2的表达。揭示了 Dec2在转录水平影响睡眠过程的机制。为了进一步验证dec2基因在斑马鱼睡眠中的功能,我们构建了 Tg（hsp70l:dec2;CG2）和 Tg（dec2:ChR2;CG2）转 基 因 鱼,发 现Tg（hsp701:dec2;CG2）在37℃热激后,睡眠时间减少,aanat2基因表达下调,hcrt基因表达量上调。Tg（dec2:ChR2;CG2）在蓝光照射后睡眠时间减少,aanat2基因表达下调,hcrt基因表达量上调,说明Dec2可以通过调控RORE元件激活hcrt的表达,通过E-box元件抑制aanat2基因的表达。综上,我们检验了 Dec2调控斑马鱼睡眠的分子机制,既通过E-box元件抑制aanat2基因的表达以抑制斑马鱼睡眠,又通过RORE元件促进hcrt的表达以促进斑马鱼觉醒,从而调控斑马鱼的睡眠。我们的研究发现了 Dec2通过绑定Rorαa后通过RORE元件促进生物钟基因bmal1b的表达,行使正向调控功能,扩展了 Dec2在生物钟中的功能,解析了Dec2调控斑马鱼睡眠的分子机制,为治疗生物钟紊乱和睡眠障碍相关疾病的治疗提供了一定的理论支持。构建的dec2斑马鱼突变体可能为筛选嗜睡症相关的药物提供良好的动物资源。