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猪2 型圆环病毒(porcine circovirus 2,PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的病原,它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡,还与仔猪A2型先天性震颤(congential tremor type A II,CT)、怀孕母猪流产(reproductive failure) 、成年猪皮炎肾炎综合征(porcine dermatitis and nephropathy,PDNS)和呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease syndrome, PRDS)有关。这些疾病的广泛流行严重影响养猪业,给好多国家和地区带来巨大的损失,更为严重的是PCV2 的感染可以造成免疫抑制,引起其他各种病原的继发感染,造成的间接损失难以估计。PCV2 已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。目前,对于PCV2感染的防制没有有效的方法和疫苗,其原因在于PCV2 对细胞感染率极低,也不出现细胞病变(CPE),另外PCV2 是哺乳动物病毒中最小的病毒之一,该病毒的纯化、浓缩难度很大,不能走传统的制造灭活疫苗等控制方法的道路。本实验希望通过分子生物学手段获得对本病毒感染行之有效的检测试剂和基因工程疫苗,为综合防制该病提供理论依据。 本论文的实验由两部分构成,一是从含有PCV2 的PK-15 细胞中克隆出PCV2 的ORF2基因,利用大肠杆菌原核表达系统,通过基因重组技术表达出ORF2基因,二是从含有PCV2的PK-15 细胞中克隆出PCV2 的ORF1、构建含有ORF1 的重组腺病毒,并在293 细胞中获得表达。主要结果如下: 1.以PCV2 的PK-15 细胞毒为材料,参照已发表的PCV2 基因组序列,设计1 对引物,应用PCR 扩增PCV2 广东株ORF2 基因的后部约600bp 片断。该PCV2-ORF2 基因已去除终止子,并在其上下游添加Kpn I 和Hind III 酶切位点。PCR 产物用Kpn I 和Hind III 酶切后与经同样处理过的pBAD/gIII B Vector 连接,转化TOP10 细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose 进行诱导, SDS-PAGE 和Western blot 分析,表明ORF2 基因确实在大肠杆菌中得到了表达,表达的多肽为28Ku。 2.根据PCV2 ORF1 基因的序列设计两条引物从PCV2 的PK15 细胞培养物中扩增出ORF1 基因(945bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T 载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF1。将PCV2 ORF1 基因克隆入pAdeasy 腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV 中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF1,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF1,然后用PacⅠ线性化后转染293 细胞,在293 细胞内包装出重组腺病毒。通过荧光显微镜观察、PCR 检测和Western blot 检测,证明PCV2 ORF1 基因在293 细胞内获得表达,且