【摘 要】
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重组FSH能够避免天然激素制剂在应用过程中的不足,体外重组表达FSH为新型激素制剂的生产带来了契机. 该研究根据已克隆的山羊FSHα、β基因cDNA序列,构建山羊重组FSH真核表达
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重组FSH能够避免天然激素制剂在应用过程中的不足,体外重组表达FSH为新型激素制剂的生产带来了契机. 该研究根据已克隆的山羊FSHα、β基因cDNA序列,构建山羊重组FSH真核表达载体,在哺乳动物细胞内进行了体外瞬时和稳定表达,为重组制剂的研制提供必备条件.构建山羊FSHα、β亚基真核表达载体并在COS-7细胞中瞬时表达.以pGEM-T-FSHβ为模板,PCR扩增FSHβ基因,通过载体与目的基因的双酶切及DNA连接,将FSHβ基因插入到真核表达载体pcDNA3.0,构建成pcDNA-FSHβ.从山羊脑垂体组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术成功扩增出FSHα cDNA序列.经与pcDNA3.o的酶切连接,构建成表达载体pcDNA-FSHα.两载体经序列测定表明插入的目的基因序列完全正确.用PolyFect转染试剂将两载体转入COS-7细胞进行瞬时表达,用放射免疫检测表达上清和细胞裂解液,有重组FSH表达,但表达效率不高.提示要获得高分泌重组产物,必须将α、β基因插入同一载体共表达.构建山羊FSHα、β双表达载体,在CHO细胞中稳定表达.设计含有酶切位点和Kozak序列的PCR特异引物,分别以pcDNA-FSHα、pcDNA-FSHβ为模板,PCR扩增FSHα、β基因.α、β基因与载体pVITRO-2用限制性内切酶酶切、DNA连接酶连接,成功构建山羊FSHα、β双表达载体pVITRO-FSHαβ.基因序列测定表明插入序列完全正确.载体用PolyFect转染试剂转染CHO细胞,经潮霉素B抗性筛选,获得稳定表达山羊FSH的CHO细胞.提取稳定表达的CHO细胞基因组DNA,PCR检测,表明山羊FSHα、β基因稳定整合到CHO基因组中.培养上清FSH放射免疫检测,发现有重组FSH的分泌. 该实验首次成功构建了山羊FSHα、β真核表达载体pcDNA-FSHα、pcDNA-FSHβ及双表达载体pVITRO-FSHαβ;在COS-7和CHO细胞中得到了表达,并获得了稳定表达山羊FSH的CHO细胞.为重组FSH制剂生产及长效激素的研究奠定了基础.
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