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大肠杆菌O157:H7是医学和兽医学临床感染中常见的病原菌之一,建立快速检测方法对食品安全和人类健康具有重要意义。大肠杆菌O157对多种抗菌药物耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为AcrAB-TolC外输泵是最主要的外输泵,能够输出多种抗菌药物、化疗试剂、洗涤剂和染料类。如果使该系统失活,大肠杆菌O157可从多重耐药状态变为相对敏感状态。本实验建立大肠杆菌O157:H7的快速检测方法,研究大肠杆菌O157:H7对氟喹诺酮类药物的基因突变耐药机制,检测临床分离的动物源性大肠杆菌O157的AcrA、AcrB基因的mRNA和蛋白的表达水平,寻找AcrA、AcrB基因的表达水平与大肠杆菌O157多重耐药水平的相关性。 动物源性大肠杆菌O157:H7的多重PCR及荧光定量PCR检测 研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR、荧光定量PCR方法并比较单一PCR和多重PCR、荧光定量PCR对检测灵敏度的影响。选择O157:H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒索基因特异的4对引物,分别或共同进行PCR扩增,检测24株O157:H7和非O157:H7菌株,将细菌按10~1～10~6稀释后比较PCR的检测灵敏度。同时设计TaqMan荧光探针进行荧光定量PCR进行灵敏度检测。所有O157:H7菌株均在497bp和625bp处出现O157抗原基因和H7抗原基因产物,其产毒株在484bp和(或)210bp处出现SLT2和(或)SLT1基因产物,非O157:H7菌株PCR结果均为阴性;单一PCR检测灵敏度为150CFU/PCR反应,多重PCR为>1 500 CFU/PCR反应,而荧光定量PCR为14CFU/PCR反应。