论文部分内容阅读
第一部分 妊娠雌鼠卵清蛋白暴露对仔鼠免疫功能的影响【目的】了解雌鼠不同孕期卵清蛋白暴露对仔鼠免疫功能的影响。【方法】分别在雌鼠孕早期(EP)、孕中期(MP)与孕晚期(LP)腹腔注射卵清蛋白(Ovalbumin,OVA),检测雌鼠不同孕期卵清蛋白暴露(OVA exposure during pregnancy,OEDP)对仔鼠免疫功能的影响。取5日龄小鼠脾脏淋巴细胞OVA体外培养,ELISA检测IFN-γ及IL-4表达以反映仔鼠对OVA致敏性及Th1、Th2因子在蛋白水平的表达,CCK-8法检测抗原特异性淋巴细胞增殖反应反映淋巴细胞对OVA的致敏性,RT-q PCR检测IFN-γ和IL-4的m RNA表达水平反映Th1、Th2因子在转录水平的变化。仔鼠6-8周龄时一次OVA暴露后ELISA检测OVA特异性Ig E反映仔鼠成年后的OVA致敏性。【结果】雌鼠孕早期(EP)、孕中期(MP)OVA暴露的5日龄仔鼠脾脏淋巴细胞抗原特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ和IL-4的表达水平无明显改变,至6-8周龄时仔鼠一次OVA暴露后OVA特异性Ig E亦无明显上升。雌鼠孕晚期(LP)OVA暴露的5日龄仔鼠抗原特异性淋巴细胞增殖反应增强,IFN-γ蛋白表达及m RNA表达水平均下降,IL-4蛋白及m RNA表达水平升高;6-8周龄仔鼠一次OVA暴露后OVA特异性Ig E升高。【结论】1.LP雌鼠OVA暴露的5日龄仔鼠再次OVA暴露后出现较强的免疫改变,如IFN-γ降低、IL-4升高、抗原特异性淋巴细胞反应增高,提示仔鼠宫内被OVA致敏,再次证实致仔鼠OVA宫内致敏的敏感期为雌鼠孕晚期。2.LP雌鼠OVA暴露的仔鼠6-8周龄时一次OVA再暴露后OVA特异性Ig E升高,提示LP雌鼠OVA暴露致仔鼠OVA致敏性增高可延续至成年期;3.宫内致敏可能是仔鼠发生过敏性疾病的始动因素,致敏性可延续至成年期。第二部分 妊娠期雌鼠OVA暴露的成年仔鼠多次OVA再暴露的免疫反应【目的】观察雌鼠妊娠期OVA暴露的仔鼠6-8周龄时多次OVA再暴露后体内出现的免疫反应。【方法】雌鼠OEDP的仔鼠6-8周龄多次OVA再暴露,观察记录小鼠症状变化并评分;ELISA法检测血清OVA特异性Ig E;提取脾脏原代淋巴细胞体外OVA培养48h后ELISA法检测培养上清IFN-γ及IL-4表达水平;流式细胞术检测脾脏淋巴细胞功能变化。【结果】1.不同孕期OEDP的仔鼠6-8周龄多次OVA再暴露后均出现不同程度的急性腹泻,雌鼠孕早期(EP)、孕中期(MP)OVA暴露的仔鼠较晚出现腹泻,症状较轻;雌鼠孕晚期(LP)OVA暴露的仔鼠6-8周龄时最早出现腹泻,症状亦最重;2.所有OEDP仔鼠6-8周龄多次OVA再暴露后OVA特异性Ig E均升高,以LP雌鼠OVA暴露组仔鼠升高为著;3.所有OEDP仔鼠6-8周龄多次OVA再暴露后脾脏淋巴细胞培养上清IFN-γ几无改变、IL-4均升高、IFN-γ/IL-4均降低,以LP雌鼠OVA暴露组仔鼠升高为著,IFN-γ/IL-4明显下降;4.脾脏淋巴细胞功能检测显示所有仔鼠6-8周龄多次OVA再暴露后CD4+/CD8+升高,以LP雌鼠OVA暴露仔鼠OVA再暴露后升高为著。【结论】OEDP仔鼠多次OVA再暴露后出现不同程度的腹泻,体内出现不同程度免疫功能改变,包括OVA特异性Ig E升高、IFN-γ/IL-4下降,CD4+/CD8+T淋巴细胞升高,提示所有仔鼠均出现OVA过敏,以LP雌鼠OEDP仔鼠为著,再次证明雌鼠孕晚期是宫内致敏的重要时机,或为―窗口期‖。第三部分 宫内OVA暴露仔鼠IFN-γ及IL-4基因甲基化水平【目的】观察OEDP雌鼠的仔鼠6-8周龄时OVA多次再暴露的脾脏淋巴细胞IFN-γ及IL-4基因甲基化水平。【方法】提取OEDP雌鼠6-8周龄多次OVA再暴露仔鼠血清,ELISA法检测血清总Ig E变化;仔鼠的脾脏淋巴细胞DNA,DNA经重亚硫酸盐修饰后进行焦磷酸测序检测相关基因位点甲基化改变,采用相关性分析分析5日龄仔鼠与6-8周龄仔鼠IFN-γ及IL-4基因甲基化改变以及与总Ig E表达、症状评分的关系。【结果】所有6-8周龄仔鼠多次OVA再暴露后血清总Ig E升高,以l P3仔鼠总Ig E上升为著。OEPD雌鼠的仔鼠5日龄时淋巴细胞IFN-γ及IL-4基因特定位点均无改变,至仔鼠6-8周龄时OVA多次再暴露后淋巴细胞IFN-γ及IL-4基因特定位点发生甲基化改变,所有仔鼠6-8周龄多次OVA再暴露后出现IFN-γ启动子Cp G-205、Cp G-190高甲基化,IL-4启动子Cp G-408、Cp G-393低甲基化,以l P3组相关位点甲基化改变为著。相关性分析结果显示OEDP雌鼠的仔鼠6-8周龄时多次OVA再暴露发生过敏症状严重程度与IFN-γ及IL-4基因特定位点甲基化改变呈显著相关。5日龄仔鼠与6-8周龄仔鼠多次OVA再暴露淋巴细胞IFN-γ和IL-4启动子甲基化改变无相关性。【结论】1.OEDP雌鼠的仔鼠5日龄时IFN-γ及IL-4启动子特定位点未发生甲基化改变,且与6-8周龄多次OVA再暴露后相关启动子特定位点甲基化状态改变无关;2.OEDP雌鼠的仔鼠6-8周龄时多次OVA再暴露淋巴细胞IFN-γ启动子Cp G-205、Cp G-190高甲基化,IL-4启动子Cp G-408、Cp G-393低甲基化,以LP仔鼠为著,证实表观遗传参与OVA过敏的发生过程;仔鼠发生OVA过敏症状的严重性与IFN-γ及IL-4启动子特定位点甲基化改变状态有关;3.关于IFN-γ及IL-4启动子位点及其甲基化与表达水平之间的关系尚需进一步研究。