研究背景与目的苯（Benzene,C6H6）是一种重要的环境污染物,主要来自于室内装修的涂料、有机溶剂、汽车尾气和烟草燃烧等。长期低水平苯暴露可导致慢性苯中毒,可引起严重的血液系统的损伤,如全血细胞的减少,严重者可导致骨髓异常增生综合征和白血病。苯通过不同途径进入机体后,经过一系列代谢,最后在骨髓生成终致癌物1,4-苯醌（1,4-Benzoquinone,1,4-BQ）。研究发现在苯代谢过程中可产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）,可对DNA、RNA和蛋白质等生物大分子造成氧化损伤,引起机体遗传和表观遗传的改变,进而造成血液系统更新与分化功能的障碍。微小核糖核酸,英文名为micro RNA（mi RNA或mi Rs）,是高度保守的内源性非编码RNA,通过结合靶基因m RNA的3’-非翻译区（3’-UTR）的互补序列来调节基因表达。目前的证据表明,人类基因组很大一部分受mi RNA调控,包括细胞增殖、细胞凋亡和癌症等。let-7家族是在哺乳动物中第1个被确定的mi RNAs,也是公认的抑癌基因,对干细胞的增殖和分化有重要影响。课题组前期研究发现苯暴露可抑制小鼠骨髓细胞let-7的表达,生物信息学预测发现let-7e-5p可以结合细胞凋亡基因Caspase-3和细胞周期相关基因p21,let-7e-5p可能参与苯致造血抑制的作用。本研究首先利用C57BL/6野生型小鼠建立苯中毒小鼠模型,研究苯暴露对小鼠血液系统的毒性及氧化损伤的影响,探讨let-7e-5p,p21和Caspase-3在苯暴露导致小鼠造血细胞氧化损伤中的特异性表达。进而利用人慢性髓系白血病K562细胞株构建let-7e-5p过表达细胞株,探讨其对1,4-BQ致细胞毒性的调控机制,验证let-7e-5p过表达是否通过靶向p21和Caspase-3双通路调控1,4-BQ致细胞毒性。最后通过苯暴露人群与对照人群血常规、内暴露剂量以及氧化损伤指标的比较,结合两组人群外周血中let-7e-5p、p21和Caspase-3 RNA表达的差异,分析苯内暴露水平、let-7e-5p及其通路基因水平、氧化损伤和血液学指标之间的相关性,为let-7e-5p及其通路基因异常表达作为苯诱导造血毒性生物标志的可行性提供科学依据。研究方法与结果1.苯暴露小鼠的血液毒性及let-7e-5p调控通路的特异性变化选用C57BL/6小鼠分为四组,每组6只,用皮下注射的方式进行28天苯染毒实验,染毒浓度为0,6,30和150 mg/（kg-b.w.）,染毒期间称量小鼠体重。染毒实验结束后,剥离小鼠的四肢骨及主要脏器。计算每组小鼠的脏器系数,分析苯对小鼠氧化损伤相关指标、let-7e-5p调控通路基因表达水平以及血常规的影响。结果表明150 mg/（kg-b.w.）苯染毒组小鼠体重增长明显减慢;小鼠的胸体比和肾体比减小,肝体比和脾体比增加;外周血白细胞、红细胞、中性粒细胞和淋巴细胞均显著降低。尿中苯巯基尿酸（S-phenylmercapturic Acid,S-PMA）含量随着染毒浓度增加而增加。氧化损伤指标检测中发现苯暴露组小鼠尿液中8-羟基鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHd G）含量增加。同时苯暴露小鼠骨髓细胞let-7e-5p基因的表达水平降低,Caspase-3和p21基因和蛋白表达水平升高。以上结果表明苯暴露可造成小鼠氧化应激水平升高和造血功能受到抑制,同时出现let-7e-5p、Caspase-3和p21基因的异常表达。2.let-7e-5p参与苯代谢产物苯醌的细胞毒性的作用及机制研究使用0、5、10和20μmol/L 1,4-BQ处理K562细胞株,通过MTT、Ed U和流式细胞仪等实验方法检测细胞相对增殖率、氧化应激水平、细胞凋亡和细胞周期。另外,RT-PCR法和Western Blot法检测目的基因表达以及相关通路蛋白的表达情况。结果显示,20μmol/L 1,4-BQ染毒K562细胞24小时时,细胞相对增殖率显著下降,与EDU实验结果一致;ROS水平随着染毒增加而增加;细胞凋亡率与1,4-BQ染毒浓度有剂量反应关系。在1,4-BQ的作用下,细胞周期结果显示多数细胞增殖被阻滞在G1/S期。并且RT-PCR和Western Blot显示随着染毒浓度的增加,let-7e-5p表达量下降,p21和Caspase-3 m RNA和蛋白表达量升高,表现为促进细胞凋亡和抑制细胞增殖,所有结果均在1,4-BQ浓度为20μmol/L有统计学差异。设计mimics转染K562细胞获得let-7e-5p过表达细胞株及NC对照细胞株,RT-PCR法和Western Blot法验证转染效率。使用20μmol/L 1,4-BQ处理两株细胞,同样采用MTT实验检测细胞相对增殖率;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期分布情况,RT-PCR法检测目的基因表达情况和蛋白印迹法检测基因和蛋白的表达情况。通过PCR实验结果显示let-7e-5p过表达细胞let-7e-5p相对表达量显著高于NC细胞,表明构建let-7e-5p过表达细胞株构建成功。接下来选择20μmol/L 1,4-BQ处理两株细胞,let-7e-5p过表达细胞凋亡率显著低于其NC细胞,细胞周期G1/S期的阻滞有所恢复。Western Blot结果显示两组细胞在20μmol/L 1,4-BQ染毒后,let-7e-5p过表达细胞组p21和Caspase-3蛋白表达量均显著下降。结合生物信息学软件、RIP实验和双荧光素酶实验验证let-7e-5p可在分子水平同时靶向调控p21和Caspase-3发挥生物学功能。综上结果分析得出1,4-BQ可以抑制细胞增殖,促进细胞细胞凋亡。而且let-7e-5p可以靶向p21和Caspase-3双通路调节1,4-BQ造成的细胞毒性。3.let-7e-5p及通路基因与职业性苯暴露及血液系统异常关系的研究首先对低苯暴露下的职业健康风险进行了评估,选取江苏省某造漆厂,通过问卷调查和现场卫生学监测了解各岗位的苯职业接触情况。应用我国工作场所职业病危害作业分级标准和EPA模型对该厂苯暴露人群进行职业健康风险评估结果表明,各岗位的暴露浓度均未超过我国的职业接触限值,根据“我国工作场所职业病危害作业分级”的健康风险为相对无害状态;但是EPA模型评估结果表明存在较高的致癌性和非致癌性,因此开展低苯暴露下的风险评估,对接苯人群的健康监测和早期损伤标志有重要的意义。为了探究let-7e-5p及通路基因与职业性苯暴露及血液系统异常的关系。对江苏省涉苯企业159名接苯工人进行了职业流行病学调查,同时按照性别和年龄进行1:1匹配,以非接苯的健康人群作为对照组,收集人群的基本资料、外周血和尿液。提取外周血白细胞的RNA,分析let-7e-5p、p21和Caspase-3的表达情况。将收集的尿样检测S-PMA和8-OHd G的含量。与对照组人群相比,苯暴露组人群的白细胞、红细胞、中性粒细胞和血小板含量降低。苯暴露组人群血清丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量升高,尿液中S-PMA和8-OHd G的含量显著高于对照组。PCR结果显示苯暴露人群外周血白细胞中let-7e-5p的表达量降低,p21和Caspase-3的m RNA表达升高且与对照组相比具有统计学差异。以上结果提示let-7e-5p、p21和Caspase-3的异常表达与苯致造血损伤有一定的相关性,可作为苯致造血损伤的潜在的生物标志。研究结论综上,苯染毒可致小鼠氧化损伤相关指标、血常规和基因表达水平的改变,表现为苯暴露小鼠氧化应激水平升高,let-7e-5p、Caspase-3和p21基因异常表达以及外周血象异常。同时,过表达let-7e-5p可减少1,4-BQ对细胞的增殖抑制和凋亡促进,其机制主要是通过let-7e-5p靶向Caspase-3调控的细胞凋亡通路和p21调控的细胞周期通路。接苯工人白细胞中let-7e-5p及其相关通路基因Caspase-3和p21表达异常,且与苯内暴露剂量、氧化损伤指标和血液学指标有相关性。表明let-7e-5p可能作为苯暴露氧化损伤及造血毒性的潜在生物标志物。