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脊髓损伤为脊柱外科较为严重的疾病之一,多因物理损伤导致,患者伤后常出现损伤部位以远的肢体感觉、运动,甚至二便功能障碍。脊髓损伤可分为不完全性或完全性神经损伤,依据损伤的类型和轻重程度,神经功能恢复所需时间长短不一。因神经损伤后难以自行修复,所以损伤严重者往往终生残留肢体功能障碍。这不仅降低了患者自身的生活质量,而且护理和治疗相关费用也给患者家庭带来较大的经济压力。目前脊髓损伤的发病率在逐渐升高,关于脊髓损伤后的神经修复和再生已成为所有研究人员面临的严峻挑战。伴随现代生物技术的日新月异,人们逐渐认识到神经细胞可通过干细胞的移植而再生,使损伤的神经功能得到修复。神经干细胞是干细胞成员之一,具有增殖、自我更新和分化为多种神经组织细胞的特点。神经干细胞可分为内源性和外源性神经干细胞。内源性神经干细胞在成体中枢神经系统内数量较少,再生能力较低,依靠刺激内源性神经干细胞,不足以补偿损失的神经细胞与组织,目前通过神经干细胞移植来补偿神经细胞与组织的缺失已经成为脊髓损伤的治疗方法之一。但是,神经干细胞在不断受到学术界关注的同时,也面临着诸多问题。如干细胞移植治疗的安全性问题(致瘤性)以及干细胞移植后分化率较低,分化神经元较少,无法替代受损区坏死的神经细胞等。所以在细胞移植前有必要对神经干细胞予以优化处理,进而提高细胞移植的安全性和有效性。MicroRNAs作为小的非编码RNA广泛存在于中枢神经系统内,其已被证实参与了神经干细胞的增殖和分化,通过microRNAs对神经干细胞进行基因调控从而改善其增殖与分化活动是可选的优化方案。目的:本研究的主要目的是通过基因芯片筛选出神经干细胞和神经元之间差异表达的microRNA(miR-329-3p),并进一步研究其在神经干细胞增殖和分化过程中的作用与相关分子机制,从而为神经干细胞移植修复神经损伤创造有利条件。研究方法:本实验研究分为两部分。第一部分中,于体外成功培养SD大鼠神经干细胞,通过镜下观察并拍摄神经球的生长状态和其诱导分化后的细胞形态。利用基因芯片找出在神经干细胞和神经元之间差异表达的miR-329-3p,通过RT-qPCR方法检测神经干细胞于不同分化时间点下miR-329-3p的表达情况,验证芯片结果。第二部分中,先于神经干细胞中转染miR-329-3p,通过荧光显微镜和RT-qPCR方法检测转染后miR-329-3p表达情况。利用CCK-8、EdU和PCNA法检测转染miR-329-3p后神经干细胞的增殖情况。从TargetScan和miRDB网站进行miR-329-3p靶基因预测,并利用双荧光素酶实验对靶基因E2F1进行验证。为了进一步研究miR-329-3p于神经干细胞内对E2F1的靶向调控作用,将miR-329-3p过表达后通过RT-qPCR和Western blot方法检测E2F1的表达变化。利用E2F1siRNA干扰E2F1表达,并以RT-qPCR和Western blot方法检测干扰后E2F1的表达情况。以CCK-8、EdU方法检测siRNA干扰后神经干细胞的增殖情况。为验证miR-329-3p通过E2F1调控神经干细胞的增殖,于神经干细胞内共转染miR-329-3p mimic和E2F1过表达质粒或对照质粒,进一步利用CCK-8、EdU方法检测神经干细胞增殖情况。在研究miR-329-3p对神经干细胞分化的影响时,我们于神经干细胞内过表达miR-329-3p,利用RT-qPCR、Western blot和细胞免疫荧光检测分化3日后神经元标志物Tuj1的表达情况。通过RT-qPCR和Western blot检测E2F1在神经干细胞分化过程中的表达变化。并将miR-329-3p mimic和E2F1过表达质粒或对照质粒于神经干细胞内共转染,利用RT-qPCR、Western blot和细胞免疫荧光检测分化3日后神经元标志物Tuj1的表达情况。结果:SD大鼠神经干细胞于倒置相差显微镜下观察见细胞在增殖培养基内呈球样生长,无贴壁分化。分化培养72小时后见细胞形态明显改变,伸出较长突起,呈神经元样表现。利用基因芯片找出在神经干细胞和神经元之间差异表达的miR-329-3p。RT-qPCR检测发现miR-329-3p在神经干细胞分化过程中表达量逐渐升高。荧光显微镜观察神经干细胞贴壁转染miR-329-3p mimic 24小时后转染效率约60%;悬浮转染48小时后于荧光显微镜下可见神经干细胞已聚集成球,并发出荧光。RT-qPCR检测发现miR-329-3p mimic转染神经干细胞后miR-329-3p表达明显升高。miR-329-3p的过表达对神经干细胞增殖产生抑制作用。通过生物信息学预测,并利用双荧光素酶实验验证了E2F1为miR-329-3p的靶基因。miR-329-3p于神经干细胞内抑制E2F1基因和蛋白的表达。利用E2F1siRNA可有效干扰E2F1的表达,并且E2F1被干扰后抑制了神经干细胞的增殖。将miR-329-3p mimic和E2F1过表达质粒或阴性对照质粒共转染,与对照组相比,E2F1过表达促进了神经干细胞增殖。在神经干细胞分化培养中,miR-329-3p过表达可促进神经元标志物Tuj1的基因和蛋白表达,细胞免疫荧光显示过表达miR-329-3p促进了神经干细胞向神经元的分化。在神经干细胞分化过程中,E2F1基因和蛋白表达逐渐下降。将miR-329-3p mimic和E2F1过表达质粒或阴性对照质粒于神经干细胞内共转染,发现与对照组相比,E2F1过表达组神经元标志物Tuj1的表达降低。细胞免疫荧光结果亦显示,E2F1的过表达抑制了神经干细胞向神经元的分化。结论:(1)miR-329-3p在神经干细胞和神经元中存在差异表达;miR-329-3p在神经干细胞分化过程中表达量逐渐升高。(2)miR-329-3p可抑制神经干细胞增殖,促进其向神经元分化,其作用机制与抑制靶基因E2F1表达有关。