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目的肝癌在全世界范围内居恶性肿瘤发病的第五位。流行病学调查结果显示,HBV携带者较非携带者发生肝癌(HCC)的危险率高10倍,因而HBV感染是导致肝癌发生的主要因素。HBV基因组由HBx、HBc、HBs和HBp四部分组成,它们在HBV复制中所发挥的作用已研究的较为清楚,但它们对HBV+肝癌细胞生物学表型的影响和机制尚不清楚。在HBV感染过程中,NK细胞对于HBV病毒的清除起了重要作用。NK细胞可通过释放IFN-γ和TNF-a等多种细胞因子杀伤HBV感染的肝细胞,同时NK细胞表面表达多种受体,可通过与靶细胞表面的配体结合启动杀伤信号。有研究报道,HBV感染机体后,导致机体NK细胞活化性受体NKG2D、NKp30、NKp46表达的降低,并且其分泌IFN-γ和TNF-a细胞因子的能力显著降低。此外,感染HBV的肝细胞表面活化性配体如MICA/B表达下降,并且免疫负调因子如IL-10和TGF-β分泌显著增加。为探讨HBV感染过程中HBV的哪些组分参与调控了肝细胞表面NKG2D配体的表达及其调控机制,本课题分别构建了含有HBV各组分的表达载体,将它们转染至肝癌细胞系HepG2细胞后,观察HBV的哪个或哪几个组分可以影响HepG2细胞表面MICA/B表达,并从两个方面探讨了HBV组分影响MICA/B表达的机制。第一,在转录水平上,预测并验证参与调控MICA/B的新转录因子,观察新的转录因子如何调节MICA/B的表达以及HBV各组分对这些转录因子的影响。另外,从己知的调控MICA/B的转录因子STAT3着手,验证STAT3作为抑制性转录因子的作用。第二,检测与MICA/B相关的miRNAs的变化,通过miRNAs过表达及抑制实验,进一步观察HBV各组分是否通过影响miRNAs的表达而对HepG2细胞MICA/B的表达进行调节。方法1以HepG2、HepG2-HBV和HepG2.2.15为研究对象,利用MTT和CFSE/7AAD法检测NK92细胞对其的杀伤敏感性,利用FACS技术检测上述细胞表面杀伤相关配体的表达。2构建pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs以及pEGFP-HBp表达载体,转染至HepG2细胞后,通过荧光显微镜和RT-PCR方法验证上述质粒可成功转入HepG2细胞,并且可稳定表达。用MTT和CFSE/7AAD法检测NK92细胞对转染了不同质粒的HepG2细胞的杀伤敏感性的变化。3利用Q-PCR和FACS技术,检测转染HBV各组分后,HepG2细胞表面MICA/B、ULBPs和Fas的表达。4以siRNA沉默HepG2.2.15细胞HBx和HBc后,利用Q-PCR和FACS技术检测MICA/B的表达。5在HepG2细胞中转染HBV各组分后,利用萤光素酶报告基因技术检测MICA/B启动子的活性；通过网站预测出可能调节MICA/B表达的转录因子GATA-2和GATA-3;转染HBV各组分后,Q-PCR检测GATA-2和GATA-3的变化；利用RNAi技术沉默HepG2和HepG2.2.15细胞GATA-2和GATA-3的表达,进而用RT-PCR和FACS技术检测MICA/B的表达。6沉默HepG2和HepG2.2.15细胞中GATA-2和GATA-3后,萤光素酶报告基因技术检测MICA/B启动子活性的变化。7Western Blot检测HepG2和HepG2.2.15细胞中GATA-2和GATA-3的表达,染色质免疫共沉淀检测GATA-2和GATA-3与HepG2和HepG2.2.15细胞中MICA启动子的结合,免疫共沉淀检测HBx蛋白是否与GATA-2和GATA-3结合。染色质免疫共沉淀检测HepG2.2.15细胞中转染HBx-siRNA后,MICA启动子与GATA-2和GATA-3结合区域的表达。8在HepG2细胞中转染HBV各组分后,Q-PCR技术检测miRNA20a、miRNA93和miR106b的变化；在过表达HBV不同组分的基础上,转染miRNA106b的inhibitor,利用FACS技术检测HepG2细胞表面MICA/B表达的变化。9HepG2细胞转染HBV各组分后,VVestern Blot技术检测STAT3的表达；在转染HBV各组分的的基础上,再进行STAT3-decoy转染以阻断STAT3与靶基因的结合,并用FACS技术检测肝癌细胞表面MICA/B的表达。结果1与HepG2细胞相比,HBV+的HepG2细胞对NK92细胞杀伤敏感性降低。HBV+的HepG2细胞表面的活化性配体MICA/B和ULBPs的表达降低,抑制性配体HLA-ABC基本不变,PD-L1的表达升高,而死亡受体Fas表达降低。2构建的pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs以及pEGFP-HBp表达载体转染到HepG2细胞后可稳定表达。3与转染HBs和HBp基因的HepG2细胞相比,转染HBx和HBc的HepG2细胞对NK92细胞的杀伤敏感性显著降低。4转染HBx和HBc后,HepG2细胞表面MICA/B下降更为明显,转染HBx的HepG2细胞表面ULBP2明显下降,转染HBx和HBp的HepG2细胞Fas下降明显。5在HepG2.2.15细胞中沉默HBx或者HBc后,其细胞表面MICA/B表达升高。6转染HBx和HBc可明显促进MICA/B启动子活性及GATA-2和GATA-3的表达升高。HepG2和HepG2.2.15细胞中转染GATA-2和GATA-3的siRNA降低GATA-2和GATA-3的表达,则MICA/B的表达和MICA/B启动子活性明显增加。7与HepG2细胞相比,HepG2.2.15细胞中GATA-2和GATA-3的表达较高。HepG2.2.15细胞中GATA-2和GATA-3与MICA启动子结合更多,HBx蛋白可与GATA-2或GATA-3结合。用HBx-siRNA沉默HBx后,GATA-2或GATA-3与MICA启动子的结合明显减少。8转染HBV各组分后,靶向MICA/B的miRNA20a、miRNA93和niR106b的表达水平有不同程度的增加；在HepG2中转染HBV各组分后再转染miRNA106b的inhibitor,则HBx和HBc引起的MICA/B的变化可被削弱。9转染HBx和HBc可明显促进HepG2细胞STAT3的活化,加入decoy阻断STAT3信号通路后,则HBx和HBc引起的MICA/B的变化可被削弱。结论1HBV+的肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性明显低于HBV-的肝癌细胞。2HBx和HBc可下调HepG2细胞中MICA/B的表达,从而减低NK细胞对其杀伤敏感性。3.发现GATA-2和GATA-3可以结合在MICA/B的启动子区域,在转录水平上抑制MICA/B的表达。4.发现HBV可促进GATA-2和GATA-3的表达,HBx蛋白可与GATA-2和GATA-3结合形成异源二聚体共同结合在MICA/B的启动子区域,抑制MICA/B的表达。5.HBx和HBc基因可通过活化STAT3,参与调节MICA/B的表达。6.HBV可通过影响靶向MICA/B的几种miRNA的表达,参与对MICA/B表达的抑制。