胚胎干细胞是研究基因功能、建立疾病模型和促进再生医学领域发展的一种重要工具。猪由于生理结构与人类相似,长期以来被人们作为疾病模型广泛的应用于临床研究中,因此猪胚胎干细胞的建立对于生物医学领域有着重大意义。不仅如此,猪作为农业经济动物,其胚胎干细胞的建立可以在基因工程水平上来帮助改善猪的健康水平和生长性状提高经济效益。但在猪胚胎干细胞的研究中,人们始终没有获得一株真正的胚胎干细胞系,同时猪胚胎干细胞所需要的培养条件也不能确定,在2014年我们实验组获得了一株猪类胚胎干细胞系,512506具有一定的干细胞特点,其培养液(MXV培养液),经研究是一组比较适合猪类胚胎干细胞生长的干细胞培养液。但是由于其成分过于复杂,操作性差,并不利于猪胚胎干细胞的进一步研究。在猪胚胎干细胞培养条件的探索中,人们依据大鼠胚胎干细胞的成功,2i体系也得到了广泛的应用。但却存在着相反的两种作用效果。本实验针对MXV培养液的缺点,我们对其进行了优化,找出MXV培养液中必需成分。并探索了2i对猪胚胎干细胞建系的影响。首先是针对MXV培养液的五种主要成分bFGF,hLif,BSA,N2B27,KOSR,进行逐一简化,分别通过半量降低这五种成分的培养液和全量降低这五种成分的培养液分别培养512506细胞系最终可以去掉MXV培养液中的不重要成分。得到成分简化的MXV培养液,随后,我们对MXV培养液中基础培养液进行优化,X中的基础培养液为三种基础培养液Neurobasal,KO-DMEM,和DMEM/F1的混合物。我们用单一的培养液成分来替代这个混合体系。最后可以获得简化的MXV培养液。为了进一步确定简化的MXV培养液是否可以完全替代MXV培养液,本实验探索了简化MXV培养液对猪类胚胎干细胞建系效率的影响。同时针对CHIR99021,PD0325901简称2i对于有猪多能性细胞研究中相对立的研究结果,我们探究了2i对猪胚胎干细胞建系效率的影响。经过上述内容研究的结果显示:KOSR可以从MXV培养液中去除获得MXV-K培养液,不添加KOSR的优化MXV培养液可以使512506的细胞状态更好,细胞排列紧密,脂滴消失,形态更接近人胚胎干细胞系。其他三组主要成分虽然没有bFGF对MXV培养液那么大的影响,但去除后,512506细胞系状态仍然会变差。所以在五种成分中我们只能将KOSR去除.而针对基础培养液的简化,最终可获得两组单一的基础培养液KO-DMEM和DMEM/F12的优化MXV培养液,可以完全代替MXV培养液培养512506细胞系,获得的512506P5K和512506P5D在形态上比512506细胞系更接近人胚胎干细胞系,多能性状态与512506细胞系相似。在建系效率的研究中,实验结果显示发育至6d的体外受精胚胎在KO-DMEM培养液中贴壁率和原代克隆形成率显著高于DMEM/F12培养液,添加2i后两种培养液中的胚胎贴壁率和原代克隆形成率均下降。在KO-DMEM培养液中可获得稳定传代的细胞系,细胞形态与512506细胞系不同,无脂滴,细胞排列紧密,形态更类似与人胚胎干细胞系。细胞系呈碱性磷酸酶阳性,核型正常,表达Oct4、Sox2和Nanog,不表达Cdx2。细胞系可成功进行转基因操作。结果表明以KO-DMEM为基础培养液的优化MXV培养液体系可以获得猪类胚胎干细胞,2i不利于胚胎贴壁和原代克隆形成。该研究为猪胚胎干细胞建系培养体系选择与推断猪胚胎干细胞多能性细胞信号调控通路提供了重要的实验依据。