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模式真菌灰盖鬼伞的细胞壁主要由β-葡聚糖、几丁质和蛋白质构成,其中β-葡聚糖为主要成分。本论文研究了一种新型的灰盖鬼伞β-1,6-葡聚糖酶的酶学性质及其诱导灰盖鬼伞菌柄细胞壁的伸长活性。我们从灰盖鬼伞基因组中鉴定了一种假设蛋白（XP＿001831978.2）,以下称为β-1,6-葡聚糖酶GH30A,在NCBI网站上进行蛋白质序列比对,发现其氨基酸序列与香菇内切-β-1,6-葡聚糖酶Le Pus30A（BAK52530）氨基酸序列具有58.32%的相似性。NCBI的保守区域分析表明,该蛋白在Carbohydrate-Active en Zymes（CAZy）数据库中属于糖苷水解酶（GH）30家族的成员。为了研究灰盖鬼伞的β-1,6-葡聚糖酶GH30A,使用Signal P 5.0服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P）预测此蛋白N端1-21个氨基酸为信号肽。因此,克隆没有信号肽的成熟GH30A c DNA,设计特异性引物将GH30A基因扩增出来,使用一步克隆方法将其连接在重组表达载体p PICZαA上,得到了阳性转化子,经测序后与NCBI数据库中的原始序列进行比对,发现克隆表达出的GH30A基因序列减少了12 bp（bp 211-223）的碱基,改变了15 bp的碱基,由于我们在GH30A c DNA的四个独立克隆和测序实验中获得了相同的结果,因此克隆的序列被确认为GH30A c DNA的修订序列。所以,来自灰盖鬼伞ATCC56838的GH30A由496个氨基酸组成,与先前在NCBI数据库描述的蛋白质相比,它减少了四个氨基酸并且改变了两个氨基酸（分别是位于第201位的丙氨酸变为苏氨酸,位于第260位的丝氨酸变为天冬酰胺）。我们利用毕赤酵母真核表达系统,异源重组表达了GH30A。由于利用重组表达蛋白所带的组氨酸标签,进行镍柱亲和层析分离纯化没有成功。因此我们用饱和度为85%的硫酸铵从培养基中沉淀出重组GH30A,将沉淀物溶解在50 m M Tris-HCl缓冲液（p H 7.5）中,用50 m M Tris-HCl缓冲液（p H 7.5）透析过夜,加载到DEAE-Sepharose柱上,DEAE-Sepharose柱吸附去除杂蛋白,而流出液组分显示出具有β-1,6-葡聚糖酶活性,蛋白收率为47.03%,SDS-PAGE分析仅在约53 k Da处显示一条蛋白条带。通过MALDI TOF/TOF MS分析的胰蛋白酶消化的蛋白片段的氨基酸序列表明,该蛋白条带即为灰盖鬼伞的GH30A。对GH30A进行酶学性质研究,我们发现GH30A对石耳多糖具有高达776.50U mg-1的酶活,并具有嗜热性,在温度为60°C时酶活达到最高,在60°C,p H 7.5的Tris-HCl缓冲液的条件下孵育1 h后仍保留88.85%的活性。底物特异性分析,GH30A的最适底物为石耳多糖,以石耳多糖为底物的反应动力学参数Km=0.89 g L-1,Vmax=1236.66 U mg-1。通过研究不同的金属离子和金属螯合剂EDTA对GH30A酶活是否有影响,我们发现1 m M Mn2+、Co2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、Ba2+、Mo O42-、Cr2O7-或EDTA存在下,GH30A对石耳多糖的水解活性提高了11-29%,1 m M Cu2+、Fe2+或2 m M EDTA对酶活完全抑制。GH30A可以水解Eisenia bicyclis的昆布多糖中具有连续β-1,6-糖苷键分支侧链,但不能水解Laminaria digitata的昆布多糖中的单个β-1,6-分支侧链,这显示出β-1,6-葡聚糖酶GH30A具有用于研究真菌细胞壁结构的潜在能力。使用离子色谱法来分析GH30A对石耳多糖的酶解产物。当反应5 min时,GH30A水解石耳多糖产生葡萄糖,龙胆二糖和一系列其它的?-1,6-连接的寡糖苷,表现出内切作用模式。当反应进行20 min后,dp为3-10的葡萄糖、龙胆二糖和龙胆低聚糖进一步增多,而dp>10的龙胆低聚糖减少或消失。这些结果表明该酶优先水解较大的龙胆低聚糖以产生较小的龙胆低聚糖。此外,GH30A不会水解龙胆二糖,而在GH30A水解石耳多糖的产物中,葡萄糖的量要远远高于龙胆二糖。这些结果表明,反应混合物中的葡萄糖和龙胆二糖是由灰盖鬼伞GH30A裂解dp>3的龙胆三糖和龙胆寡糖而不仅是龙胆三糖而得到的。GH30A被用来研究是否可以诱导热灭活菌柄细胞壁的伸长活性,以阐述菌柄细胞壁中多糖的化学组成和结构。研究表明,GH30A可以重建加热灭活的菌柄细胞壁的伸长,表现出最初的快速伸长,随后伸长速率迅速降低,类似于β-1,3-葡聚糖酶ENG的伸长图谱。GH30A和ENG混合重组的热灭活菌柄细胞壁伸长与两者单独作用时具有相似的伸长曲线,与几丁质酶重建的菌柄细胞壁的连续且稳定的伸长曲线不同,表明菌柄细胞壁中几丁质与β-1,6-葡聚糖交联。另外,几丁质除了和β-1,3-葡聚糖及β-1,6-葡聚糖交联外,还和其它多糖成分交联。为了了解GH30A在灰盖鬼伞菌柄和伞盖的表达量,我们使用荧光定量PCR技术对其进行了研究,对m RNA表达水平的分析表明,GH30A在灰盖鬼伞快速增长的菌柄顶部和缓慢生长的中部几乎不表达,而在不生长的基部和膨大区有微量表达;在开伞角度为0°的伞盖中也几乎不表达,在开伞角度为90°和180°的伞盖中,表达量较高,分别为20.63倍和16.29倍的m RNA丰度。GH30A在灰盖鬼伞菌柄各部位和不同时期伞盖的差异性表达,表明其与停止菌柄基部区域的生长来重塑细胞壁的要求是一致的,并且也参与了灰盖鬼伞成熟和自溶过程中细胞壁的降解。