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银耳是一种典型的二形态药食两用真菌,富含多糖、蛋白质、维生素及无机盐,被誉为“菌中之冠”。蛋白质是基因表达的产物,是生理功能的执行者,从蛋白质水平入手克隆基因,再进行基因功能的研究可以更加全面立体地阐明基因所起到的实际功能,进而可以更好地理解生命活动的发生机理及调控规律。本研究采用Tris-饱和酚法提取银耳芽孢及菌丝总蛋白后,应用2-DE及MALDI-TOF MS/MS技术找出并鉴定了银耳芽孢及菌丝这两个不同生长发育阶段的差异表达蛋白,并根据其中2个差异表达蛋白的氨基酸序列设计简并引物,克隆了其差异表达基因,为银耳不同生长发育阶段调控机制的研究奠定了基础。结果如下:1、在液氮研磨的基础上,采用超声波与高压均质破碎细胞,通过显微镜观察细胞破碎效果、Bradford法测定蛋白含量并进行SDS-PAGE凝胶电泳分析,比较了Tris-饱和酚法、TCA/丙酮沉淀法及Tris-饱和酚结合TCA/丙酮沉淀法提取银耳芽孢总蛋白的效果,结果表明高压均质的细胞破碎效果优于超声波,三种方法所得到的蛋白含量分别为2.33 mg/mL、1.26 mg/m L及1.02 mg/mL,且Tris-饱和酚法所得电泳条带亮度及清晰度均优于其他两种方法。进而应用Tris-饱和酚法提取银耳菌丝总蛋白同样取得了很好的效果,从而建立了银耳芽孢及菌丝总蛋白的一种有效提取方法。2、应用Tris-饱和酚法提取的银耳芽孢及菌丝总蛋白通过2-DE分析选取了53个差异蛋白点,将这些差异蛋白点进行MALDI-TOF MS/MS分析,通过在数据库进行比对鉴定出11个蛋白点,分析这11个蛋白质的功能和性质后发现多数与代谢途径TCA循环有关,从而可以推测,代谢途径的差异与银耳在芽孢和菌丝这两个不同生长发育阶段蛋白质的差异表达是有密切联系的。3、根据差异表达蛋白硫蛋白-异戊烯半胱氨酸氧-甲基转移酶和细胞色素氧化酶亚基的氨基酸序列分别设计简并引物,提取银耳芽孢总RNA后,再通过RT-PCR、PCR扩增等技术克隆了其相应的差异表达基因。