【摘 要】
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毕赤酵母(Pichia pastoris)与大肠杆菌(Escherichia coli)分别是真核生物与原核生物,两种菌高分泌的特点使它们以及以它们为基础的一系列突变菌株成为真核与原核表达系统的代表。毕赤酵母表达系统可以高效地表达一些复杂的外源蛋白。本研究通过合成半夏cDNA成功构建出毕赤酵母半夏cDNA文库。总共挑选并保存1080个单克隆转化子。在实验过程中对这1080个转化子进行了两方面的筛选
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毕赤酵母(Pichia pastoris)与大肠杆菌(Escherichia coli)分别是真核生物与原核生物,两种菌高分泌的特点使它们以及以它们为基础的一系列突变菌株成为真核与原核表达系统的代表。毕赤酵母表达系统可以高效地表达一些复杂的外源蛋白。本研究通过合成半夏cDNA成功构建出毕赤酵母半夏cDNA文库。总共挑选并保存1080个单克隆转化子。在实验过程中对这1080个转化子进行了两方面的筛选,分别是:1.用玉米纹枯菌(Rhizoctonia solani)与转化子进行对峙培养,从中筛选抗纹枯菌的基因;2.从这些转化子中筛选自溶基因。本研究对所建的文库做了 PCR检测,发现都有条带,说明这是一个高质量的文库;还对筛选方法进行了诸多探索,多用划线的方法进行基因的筛选。本研究通过多种方法最终从污水中分离到一株大肠杆菌噬菌体,经纯化后照电镜观察形态,为长尾噬菌体;提取噬菌体的DNA进行酶切后测序得到部分序列,在NCBI上比对确定该噬菌体为Escherichia phage JMPW1。大肠杆菌表达系统是最为常用的表达系统。λ噬菌体的溶源菌BL21(DE3)拥有T7RNA聚合酶基因,而pET表达系统由于拥有T7启动子,在IPTG诱导的情况下T7启动子下游的外源基因高效表达。本研究应用pET表达系统(所选载体为pET-22b(+)),以BL21(DE3)为宿主菌成功构建了半夏cDNA文库。共挑取并保存了 1380个单克隆转化子。同样经PCR检测条带大小正常,也是一个高质量的库。本研究对所构建的大肠杆菌半夏cDNA文库中抗噬菌体基因进行了多次筛选,探索并尝试了三种筛选方法:1.丝裂霉素诱导处理法;2.重新提取质粒转化法;3.重新摇菌划线排除法。
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