论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,其主要病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元选择性丢失,并且在残存神经元内形成以α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)聚集为主的路易小体(Lewy bodies,LBs)。在正常的生理条件下,α-Syn不具有神经毒性,但在某些因素的作用下,能够引起α-Syn的错误折叠,在细胞膜以及细胞内形成聚集体,最终导致神经元的死亡。第一个发现并与PD相关的基因就是α-Syn(SNCA)基因。有文献表明,PD的发生可能与免疫失调有关,与免疫相关的蛋白干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1,IRF-1)是一种含有329个氨基酸的蛋白质,受到刺激后可迅速在胞浆中合成,并进入细胞核内参与下游基因的转录。IRF-1参与了免疫应答、调节细胞凋亡等多种细胞过程的调控,我们应用RNA-Seq技术发现,在过表达α-Syn的原代细胞中,IRF-1的表达升高,但是其机制尚未明确。IRF-1的转录受JAK-STAT通路的影响,其蛋白质的代谢受泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)和自噬-溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway,ALP)影响。那么在PD发生时,α-Syn的聚集是否会影响IRF-1的水平?以及是否通过UPS或ALP影响IRF-1代谢?深入研究PD中α-Syn对IRF-1的调控机制,将有助于阐明免疫反应在PD中的作用。针对这一研究目的,我们选用过表达野生型α-Syn(wild-typeα-synuclein,WTα-Syn)和A53T突变型α-Syn(A53Tα-synuclein,A53Tα-Syn)的SH-SY5Y细胞模型,以及携带人A53T突变型α-Syn(α-Syn A53T+/+)的PD转基因小鼠为研究对象,采用免疫荧光、分子生物学等实验方法,观察IRF-1的总蛋白、细胞核蛋白和胞浆蛋白表达水平的变化,及对IRF-1的核移位的影响。与此同时,观察IRF-1及其上游JAK-STAT通路各信号因子mRNA的表达变化。加入泛素蛋白酶体抑制剂MG-132或自噬溶酶体抑制剂氯喹,研究α-Syn对IRF-1的蛋白降解途径的影响。通过泛素化实验研究α-Syn对IRF-1泛素化修饰的影响。在过表达α-Syn的情况下,检测IRF-1的E3泛素连接酶鼠双微体基因-2(murine double minute 2,MDM2)的蛋白表达水平。实验结果如下:1.在SH-SY5Y细胞中,转染带有EGFP荧光标签的WTα-Syn与A53Tα-Syn质粒,成功构建过表达α-Syn的SH-SY5Y细胞模型。在上述模型中,α-Syn的mRNA表达明显增多,与对照组相比,差别具有高度统计学意义(P<0.001);α-Syn的蛋白表达亦明显增多,分别升高了73%和106%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001)。2.在过表达WTα-Syn和A53Tα-Syn的SH-SY5Y细胞中,IRF-1蛋白表达明显增加,分别升高了57%和118%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001)。在3月龄及6月龄α-Syn A53T+/+PD转基因小鼠黑质区中,IRF-1的蛋白表达水平上调,分别升高了73%和86%,与同窝野生型小鼠相比,差别具有高度统计学意义(P<0.001)3.免疫荧光染色结果显示,过表达WTα-Syn及A53Tα-Syn组内IRF-1蛋白在细胞核表达的比例升高,分别升高了98%和123%,与对照组相比,差异有高度统计学意义(P<0.001)。为了进一步验证该结果,对细胞进行核浆分离后,使用Western Blots技术发现,过表达WTα-Syn及A53Tα-Syn组,其细胞核IRF-1的蛋白表达明显升高,分别升高了1.9倍和2.3倍,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.001),而胞浆中IRF-1的蛋白表达不变。4.在过表达WTα-Syn和A53Tα-Syn的SH-SY5Y细胞中,IRF-1的mRNA水平与对照组相比,无明显变化(P>0.05)。且其上游JAK-STAT通路细胞因子JAK1、JAK2、STAT1α、STAT1β的mRNA水平均无变化,与对照组相比,差别无统计学意义(P>0.05)。5.经0.2μM泛素蛋白酶体抑制剂MG-132处理24 hrs后,过表达WTα-Syn和A53Tα-Syn的SH-SY5Y细胞,IRF-1的表达水平明显增高,分别增高了23%和42%,与对照组相比,差别有高度统计学意义(P<0.01)。但经30μM自噬溶酶体抑制剂氯喹处理24 hrs后,IRF-1蛋白水平无显著变化。6.在HEK293T细胞中,分别转染Myc-IRF-1/HA-空载体/Flag-空载体、Myc-IRF-1/HA-Ub/Flag-空载体、Myc-IRF-1/HA-Ub/Flag-WTα-Syn、Myc-IRF-1/HA-Ub/Flag-A53Tα-Syn,与Myc-IRF-1/HA-空载体/Flag-空载体组相比,Myc-IRF-1/HA-Ub/Flag-WTα-Syn、Myc-IRF-1/HA-Ub/Flag-A53Tα-Syn组IRF-1的泛素化水平明显降低。7.在过表达WTα-Syn和A53Tα-Syn的SH-SY5Y细胞,IRF-1的E3泛素连接酶MDM2的蛋白水平明显降低,分别降低了31%和60%,与对照组相比,差别具有高度统计学意义(P<0.01)。在3月龄以及6月龄α-Syn A53T+/+PD转基因小鼠黑质区,观察到MDM2蛋白的表达水平明显下降,分别下降44%及54%,与同窝野生型小鼠相比,差别具有高度统计学意义(P<0.001)。综上所述,过表达α-Syn对IRF-1的调控并非发生在转录水平上,而是通过下调MDM2水平,抑制IRF-1的泛素蛋白酶体途径,导致IRF-1蛋白水平的升高,进而促进IRF-1进入细胞核中。但是,IRF-1在PD中发挥何种作用,仍需进一步研究。本研究对α-Syn调控IRF-1的变化及机制提供了部分实验依据,为进一步明确IRF-1参与PD的发病机制提供一定的实验依据。