论文部分内容阅读
研究背景肠易激综合征（irritable bowel syndrome,IBS）通常以腹部的疼痛或者腹部感觉不适并且有些患者会伴随排便困难或者异常表现的肠功能异常,有些IBS患者还会出现不同程度的精神情绪障碍,其中焦虑出现的可能性最高。有研究显示焦虑可一定程度上加重IBS患者出现腹部的疼痛或腹部的不适。但是,目前焦虑是如何诱发IBS患者出现相关症状的机制尚需进一步探讨。脑-肠轴是在不同层次将胃肠道与中枢神经系统联系起来的神经-内分泌网络,其中内脏高敏感是IBS发生的重要环节,专家学者们近年来对内脏高敏感的发病机制的相关研究多集中在脑-肠轴。。精神情绪发生障碍时,会一定程度上诱发大脑相应脑区出现活化,从而引起神经通路、内分泌通路或神经-内分泌通路的改变,从而引起肠神经系统的敏感（entericnervous system,ENS）,相应脑区在接受到以上信号后也会加重疼痛的感觉。解决焦虑诱发的脑-肠轴互动异常是如何参与IBS内脏高敏感发生的这一问题,对进一步理解精神情绪障碍诱发IBS内脏高敏的发病机制有重要意义。脑肠肽通常双重分布在中枢神经系统和胃肠道系统,它属于一种肽类分子。搭建脑肠互动的连接桥梁,并且具有一定的调控功能。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）在脑组织及肠道双重分布,是一种比较常见的的神经营养因子。既往有研究显示BDNF在杏仁体、海马等中枢神经系统的表达与焦虑的发生密切相关。肠道中的BDNF与IBS患者发生腹痛、腹部的不适等症状的程度以及频率等有很大的关系,参与IBS内脏高敏感的发生。基于以上研究,我们推测BDNF可作为一种脑肠肽调控焦虑诱发的IBS内脏高敏感,在调节IBS脑-肠互动中发挥着不可或缺的作用。然而,BDNF将脑部焦虑信息传递到肠道,引起内脏高敏感发生的分子机制有待研究。促肾上腺皮质激素释放因子（corticotropinreleasingfactor,CRF）可以自由通过血脑屏障,是情绪心理等相关应激反应的重要调节因子,,。研究发现促肾上腺皮质激素释放因子与IBS患者的心理等相关应激和内脏的高敏感相关。在中枢,BDNF通过活化CRF神经元上蛋白酪氨酸激酶受体B（TrkB）受体,引起CRF的合成释放,发挥生物学效应,但是否参与调控内脏高敏感尚不明确。CRF亦可以活化小脑神经元上CRF1受体激活BDNF启动子,引起BDNF转录、翻译和表达,从而发挥BDNF相应的生物学效应。在肠道,CRF的主要作用受体为CRF1,阻断CRF1受体可以减轻中枢或外周增加的CRF引起的内脏高敏感,表明CRF1信号通路参与调节IBS内脏高敏感的发生,但机制不明,CRF是否通过类似于中枢的机制,作用于CRF1的受体,导致内脏高敏感的发生。基于以上理论基础及实际问题,本研究拟分为两个部分,应用焦虑伴内脏高敏感大鼠模型,结合IBS伴焦虑患者,从脑-肠轴水平,分别对焦虑诱发的BDNF-CRF脑-肠互动的中枢与外周机制进行探索。第一部分:焦虑诱发的脑BDNF-CRF在IBS内脏高敏感发病中的作用研究目的从脑-肠轴的中枢层面（脑）探讨BDNF-CRF互动在焦虑诱发内脏高敏感中的作用。研究方法1.建立脑-肠轴功能紊乱的母婴分离（Maternal separation,MS）大鼠模型,利用矿场试验（open-fieldtest,OFT）检测母婴分离大鼠的焦虑程度,利用结直肠扩张实验（Colorectal distension,CRD）结合腹壁撤退反射评分（Abdominal withdrawal reflex,AWR）来进一步评估大鼠的内脏高敏感水平,并通过Spearman相关性分析验证焦虑与内脏高敏的相关性。2.利用免疫组化、聚合酶链式反应（PCR,Polymerase Chain Reaction）以及酶联免疫吸附试验（ELISA,Enzyme linked immunosorbentassay）及等方法来检测脑边缘系统（海马、扣带回和杏仁体）-血清BDNF表达与含量,并通过Spearman相关性分析验证BDNF浓度与焦虑、内脏高敏感的相关性。3.结合脑室（中枢）注射（intracerebroventricular injection,ICV）BDNF受体TrkB受体阻滞剂K252a,利用AWR评分评估正常对照组、MS组和MS+K252a组各组大鼠的内脏高敏感变化,利用免疫组化、ELISA检测以上各组脑（海马）-血清CRF表达与含量。研究结果1.OFT结果显示,MS组的大鼠修饰次数明显高于对照组大鼠（p＜0.05）,然而在中央区的停留时间百分比、直立次数以及中央区穿越次数显著低于对照组大鼠（P＜0.05）,表明MS组大鼠表现为焦虑状态。结直肠扩张实验（CRD）中,当CRD的灌注体积为0.4、0.6、0.8、1.0及1.2ml时,MS组的AWR评分均高于对照组（P＜0.05）,表明MS组大鼠表现为内脏高敏感状态。本研究中对MS组大鼠的中央区停留时间百分比与1.2ml灌注体积CRD时AWR评分行Spearman相关分析,结果显示二者呈负相关,相关系数（r值）为-0.79（P＜0.05）,因大鼠的中央区停留时间百分比与焦虑水平是负相关的关系,AWR评分与内脏高敏感是正相关的关系,所以以上提示MS组大鼠焦虑和内脏高敏感具有明显正相关性,焦虑水平越高,内脏高敏感程度越高。2.本研究中免疫组化发现MS组大鼠海马区的BDNF表达显著高于对照组（P＜0.05）,但是扣带回、杏仁核的BDNF含量无明显变化（P＞0.05）。进一步PCR分析发现MS组大鼠海马区的BDNF的mRNA水平明显高于对照组（P＜0.05）,但是扣带回、杏仁核BDNF未发生明显变化（P＞0.05）。ELISA结果显示,MS组大鼠海马区BDNF的蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）,扣带回、杏仁核及血清BDNF无明显变化（P＞0.05）。另外,MS组大鼠海马区的BDNF蛋白表达水平与中央区停留时间百分比呈负相关,相关系数（r值）为-0.78（P＜0.05）,与1.2ml的AWR评分两者之间呈正相关,r值为0.93（P＜0.05）。综上结果表明MS组大鼠的海马脑区BDNF的表达增加,并且与焦虑、内脏高敏感呈正相关;3.免疫组化分析结果显示,MS组大鼠的海马区CRF的表达显著高于对照组（P＜0.05）。ELISA分析结果显示,MS组大鼠海马区中CRF的蛋白表达水平高于对照组（P＜0.05）,但血清CRF未发生明显变化（P＞0.05）。4.脑室（中枢）注射BDNF受体TrkB受体阻滞剂K252a后,免疫组化分析结果显示,MS+K252a组大鼠的海马区中的CRF的表达显著低于MS组（P＜0.05）。ELISA分析结果显示,MS+K252a组的大鼠海马区中的CRF的蛋白表达水平低于MS组（P＜0.05）,但血清CRF未发生明显的变化（P＞0.05）。结直肠扩张实验（CRD）中,当CRD的灌注体积为0.4、0.6、0.8、1.0及1.2ml时,MS+K252a组的大鼠的AWR评分均低于MS组大鼠（P＜0.05）。综上可知BDNF受体阻滞剂可明显降低MS大鼠的CRF的表达与内脏高敏感水平。研究结论1.MS大鼠表现出明显的焦虑伴内脏高敏感,且二者呈正相关,存在脑-肠轴互动异常。2.MS大鼠的海马区测BDNF表达增加,与焦虑和内脏高敏感呈正相关,共同参与调控脑-肠互动。3.MS大鼠海马CRF表达增加,受BDNF调控,证实中枢“BDNF-TrkB-CRF”通路参与IBS脑-肠轴互动异常。第二部分:焦虑诱发的肠BDNF-CRF在IBS内脏高敏感发病中的作用研究目的从脑-肠轴的外周肠道层面探讨BDNF-CRF互动在焦虑诱发内脏高敏感中的作用。研究方法1.首先根据纳入排除标准,将本研究正常对照者与符合罗马Ⅳ诊断标准的IBS患者纳入,再利用医院焦虑抑郁量表（Hospital anxiety depression Scale,HADS）将符合条件的受试者分为焦虑组和非焦虑组。对其进行一般资料的记录,和腹痛症状（严重程度和发作频率）的评分。2.利用免疫组化、ELISA等方法检测正常对照者、IBS不伴焦虑患者及IBS伴焦虑患者各组肠道BDNF的表达与含量;并利用Spearman相关性分析进一步分析IBS伴焦虑患者的BDNF与焦虑、腹痛症状及腹痛频率之间的相关性。3.建立焦虑伴内脏高敏感MS大鼠模型,结合脑室（中枢）注射BDNF受体TrkB受体阻滞剂K252a,利用AWR评分评估对照组、MS组及MS+K252a组大鼠内脏高敏感水平。利用ELISA以及免疫组化等方法进一步检测各组大鼠肠道中BDNF的变化。4.结合CRD利用ELISA方法检测对照组与MS组肠道与血清CRF的蛋白表达变化;利用Western Blot检测两组大鼠肠道中CRF1受体的变化。5.结合腹腔注射不通过血脑屏障的CRF1受体阻滞剂astressin,利用AWR评分评估MS+vehicle组与MS+astressin组大鼠内脏高敏感水平。利用免疫组化以及ELISA来检测两组大鼠肠道中BDNF的变化。研究结果1.本研究中IBS患者与健康对照组患者在年龄和性别上未发现有明显差异。HADS焦虑评分,IBS患者显著高于对照者（P＜0.05）,且IBS伴焦虑患者高于IBS不伴焦虑患者（P＜0.05）。IBS患者组的腹部症状严重程度评分显著高于对照者（P＜0.05）,且IBS伴焦虑患者高于IBS不伴焦虑患者（P＜0.05）。IBS患者腹部症状发作频率评分明显高于对照者（P＜0.05）,且IBS伴焦虑患者评分较高（P＜0.05）。2.免疫组化和ELISA分析结果显示,IBS患者结肠黏膜BDNF的表达和蛋白浓度水平量显著高于对照组（P＜0.05）,其中IBS伴焦虑患者的结肠黏膜中的BDNF水平较高（P＜0.05）。Spearman关联性分析显示,伴焦虑IBS患者肠粘膜活化BDNF蛋白表达水平与HADS焦虑症状评分呈正相关,相关系数（r值）为0.89（P＜0.05）;与腹痛/腹部不适症状严重程度、腹痛/腹部不适症状发作频率评分之间均呈正相关（r=0.89=,r=0.77,P＜0.05）。这提示IBS患者的肠粘膜中的BDNF含量有所增加,尤其是在IBS伴焦虑患者,且BDNF含量与焦虑和腹部症状呈正相关。3.免疫组化和ELISA结果显示,MS组大鼠结肠黏膜BDNF的表达和蛋白浓度水平高于对照组大鼠（P＜0.05）。当给予MS大鼠中枢脑室注射TrkB受体阻滞剂K252a抑制后,MS+K252a组大鼠结肠黏膜BDNF的表达和蛋白浓度明显降低（P＜0.05）。AWR评分结果显示MS组大鼠的内脏敏感性明显高于对照组大鼠（P＜0.05）,同时较MS组,MS+K252a组大鼠内脏敏感性降低（P＜0.05）。以上结果提示MS大鼠结肠BDNF表达增加及内脏高敏感升高,且这些作用可被BDNF受体TrkB受体阻滞剂K252a阻断。4.给予MS组大鼠灌注体积为1.2ml CRD时,ELISA结果示MS组大鼠结肠CRF的蛋白表达水平升高（P＜0.05）。同样在血清,给予CRD后MS组大鼠血清CRF的蛋白表达水平升高（P＜0.05）。Western blot分析结果显示,MS组大鼠的结肠中的CRF1受体水平高于对照组大鼠的CRF1受体水平（P＜0.05）。这表明MS大鼠的结肠中CRF及其受体（CRF1）表达增加。5.给予MS大鼠腹腔注射CRF1受体阻滞剂astressin,免疫组化与ELISA分析结果显示,MS+astressin大鼠结肠黏膜中的BDNF水平较低（P＜0.05）。MS+astressin组大鼠的内脏敏感性低于MS+vehicle组（P＜0.05）。这表明MS大鼠结肠BDNF表达及内脏高敏感可被CRF1受体阻滞剂阻断。研究结论1.IBS伴焦虑患者的肠粘膜中的BDNF水平升高,与焦虑和内脏高敏感水平呈正相关,参与调节IBS患者脑-肠互动。2.MS大鼠肠道BDNF增加,且可被中枢调控,在IBS脑-肠轴互动异常中发挥作用。3.MS大鼠肠道CRF与CRF1受体增加,BDNF表达受CRF1受体调控,证实外周肠道“CRF-CRF1-BDNF”通路参与IBS脑-肠轴互动异常。研究意义在IBS伴焦虑患者和MS模型大鼠中,本研究验证了伴焦虑IBS脑-肠轴上游-脑区边缘系统（海马）BDNF表达上调,通过活化TrkB引起CRF合成释放增加;肠道CRF通过激活CRF1受体,引起肠道BDNF合成释放增加,致内脏高敏感,加重腹痛、腹部不适症状。首次从脑-肠轴（中枢和外周）层面明确了焦虑诱发的BDNF-CRF脑-肠互动参与IBS内脏高敏感的发病,这进一步说明脑肠肽BDNF调控脑-肠互动。通过调控脑-肠轴上BDNF-CRF的脑-肠互动,有望平衡IBS患者脑-肠互动异常,改善焦虑与内脏高敏感症状。