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猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起猪的一种高度接触性传染病,以出血性高热和免疫抑制为主要特征,由于该病给养猪业造成毁灭性的打击,并影响国际间的贸易,因此,被世界动物卫生组织(OIE)列入OIE疾病名录,为需申报的(Notifiable)动物传染病,我国将其列为一类传染病。猪瘟病毒(CSFV)是黄病毒科(Flavivirdae)瘟病毒属(Pestivirus)的重要成员,为有囊膜的单股正链RNA病毒,CSFV的基因组大小约为12.3Kb,编码3898个氨基酸的多聚蛋白,此多聚蛋白经病毒Npro和宿主细胞的蛋白酶作用,裂解成4个成熟的结构蛋白(C,Ems, E1和E2)以及至少7个非结构蛋白(P7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A和NS5B)。CSFV对血管内皮细胞(Endothelial cells, ECs)和外周血白细胞(Peripheral blood leucocyte cells, PBLs)等免疫活性细胞高度易感。ECs衬贴于心血管系统的内表面,为单层扁平上皮,其具有很多生理功能,包括参与凝血反应,炎症反应、调节免疫、调控血管内皮通透性等。ECs和PBLs能够分泌一些炎性细胞因子和趋化因子,其中某些细胞因子又是血管通透性升高的增强剂。CSFV感染猪的典型病理变化是全身脏器的广泛性出血,其造成广泛性出血的机制尚未明确。为了探讨CSFV感染引起的出血机制,本研究以分离的猪原代血管内皮细胞(Porcine umbilical vein endothelial cells, PUVECs)和猪体的PBLs为研究对象,开展了CSFV感染PUVECs的增殖动力学研究,CSFV感染PUVECs的蛋白质组分析,以及CSFV感染PUVECs促炎细胞因子和趋化因子的表达变化研究。为了进一步研究CSFV感染后宿主体内炎症因子的变化情况,本研究还检测了CSFV感染猪的PBLs细胞因子和趋化因子的转录动态变化。在获得CSFV感染宿主的细胞因子表达谱的基础上,又针对表达上调的趋化因子IP-10对CSFV复制能力的影响进行了初探。本研究采集健康的新生仔猪脐带,应用Ⅰ型胶原酶灌注消化的方式分离了PUVECs。将制备的PUVECs应用CSFV高致病力毒株(shimen株)进行感染,发现CSFV感染PUVECs不产生细胞病变(Cytopathic Effect，CPE),病毒感染的48h,90%以上的细胞感染了CSFV,并且此时病毒感染PUVECs的病毒载量(病毒效价和基因拷贝数)达到高峰,为此确定了二维荧光凝胶差异电泳(Twodimensional difference gel electrophoresis with fluorescent dyes,2D-DIGE)分析的最佳时间为CSFV感染后的48h。2D-DIGE分析获得了8个差异表达蛋白,包括4个上调和4个下调的表达蛋白。在这些差异表达的蛋白中,参与糖代谢的磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，葡萄糖苷酶II(glucosidaseⅡ),酮糖转移酶(TK)发生了不同程度的下调变化,表明CSFV感染抑制了ECs的糖代谢,不利于细胞的能量合成；与细胞周期和细胞增殖相关的磷蛋白(stathmin-1)和酮糖转移酶(TK)发生差异表达,表明CSFV感染影响了ECs的增殖；与病毒复制相关的α-微管蛋白下调,表明CSFV可能利用微管蛋白进行复制；具有抗氧化应激和抑制细胞凋亡功能的抗氧化应激蛋白过氧化物酶-6 (PRDX6)上调表达,这种变化会抑制PUVECs的凋亡,可能是PUVECs感染CSFV不产生细胞病变的机制之一；参与调控血管内皮通透性和炎症反应的膜突蛋白(Moesin)表达变化,这可能与CSFV感染的出血发生有关。血管内皮细胞和白细胞均可以表达和分泌细胞因子,二者在血管内相互作用,共同介导宿主的免疫反应和炎症反应。本研究进行了CSFV体外感染PUVECs和体内诱导PBLs的细胞因子和趋化因子的表达变化分析。CSFV感染PUVECs48h后,细胞因子和趋化因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1、IP-10、ICAM的mRNA转录水平上升13倍以上,而VCAM和IFN-y基本未发生改变。与未感染的对照相比,CSFV感染PUVECs后上清中细胞因子IFN-γ含量无明显变化；IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、TNF-α、IL-8含量在24h p.i或48h p.i明显高于未感染的对照组。这些细胞因子和趋化因子的转录水平和蛋白表达水平的趋势基本-致。将CSFV shimen血毒接种50日龄仔猪,分别在CSFV感染前,感染后的2d,4d,6d和8d采集猪前腔静脉外周血,分离PBLs,通过Real time RT-PCR检测PBLs中细胞因子的mRNA转录水平。与感染前相比较,CSFV感染PBLs导致IL-1α,IL-4、IL-6、1L-10和TNF-amRNA转录水平快速上升,分别在6 d p.i或8 d p.i达到高峰,IL-1α,IL-4、IL-10和TNF-α在8 d p.i达到高峰,转录分别上调了239,48、345和46倍；IL-6在6 d p.i达到高峰,转录上调了10倍。CSFV感染后,PBLs表达的趋化因子IP-10在4 d p.i达到高峰,转录上调了86倍。CSFV感染导致IL-8上调20倍(2 d p.i)到42倍(4 d p.i),然后呈下调态势,下调了1.5倍(6 d p.i)到10倍(8 d p.i)。IFN-γ的转录水平在感染前和感染后保持恒定。由此可见,CSFV体外和体内感染均导致促炎细胞因子和趋化因子表达上调。本研究结合蛋白组学和细胞因子的数据,初步分析了CSFV感染PUVECs和PBLs的细胞因子、趋化因子和差异蛋白的相互作用反应网络。CSFV感染免疫活性细胞的细胞因子表达谱分析发现IP-10上调表达,我们通过构建表达IP-10的PK-15细胞系方式,比较了CSFV在该细胞系和正常PK-15细胞上的增殖能力。CSFV感染IP-10细胞系实验组的病毒载量略低于pLXSN-EGFP转染对照组和PK-15细胞对照组,但无显著差异。结果表明IP-10的上调表达对CSFV复制影响不明显。本研究对CSFV感染的蛋白质组、细胞因子和趋化因子表达谱进行了系统的分析,鉴定的这些差异表达蛋白和表达变化的细胞因子以及趋化因子体现着宿主细胞PUVECs和PBLs对CSFV感染的总体反应模式,为从病毒与宿主相互作用角度揭示CSFV的致病机理奠定了基础。