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临床研究维生素D/维生素D受体与肿瘤免疫治疗相关不良反应第一部分 维生素D水平与肿瘤免疫治疗相关不良反应的相关性分析背景:免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor,ICI）在肿瘤治疗的应用中具有划时代的意义,然而免疫相关不良反应（immune related adverse events,irAEs）是肿瘤免疫治疗的瓶颈。维生素D（Vitamin D,VitD）具有免疫调节作用,维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）在免疫细胞中广泛表达。目的:本研究旨在探讨血清25羟维生素D（25-hydroxyvitamin D,25（OH）D）水平与ICI疗效及irAE的发生和严重程度之间的关系。方法:纳入初始接受程序性细胞死亡受体-1（programmed cell death receptor-1,PD-1）抑制剂治疗后发生/未发生irAE晚期肿瘤患者77例,收集其临床资料并采用液相色谱串联质谱法检测ICI治疗前后血清25（OH）D水平。结果:共纳入77名患者,其中发生irAE患者29名和未发生irAE患者48名。在29名发生irAE的患者中,单发性irAE17例,多发性irAE12例,共发生42项irAE事件。部分缓解组（partial response,PR）患者的基线25（OH）D水平显著高于non-PR 组（19.39±7.16 ng/ml vs.16.28±5.99 ng/ml,P=0.04）。维生素 D 正常组、维生素D不足组和维生素D缺乏组的中位总生存期（overall survival,OS）分别为429天、372天和379天,具有显著统计学差异（P=0.02）。在发生irAE的患者中,轻度irAE（1级）组的基线25（OH）D水平高于中重度irAE（2/3/4级）组（20.07±8.64 ng/ml vs.15.22±2.30 ng/ml,P=0.02）。ICI 治疗前后 25（OH）D 水平改变无统计学意义（P＞0.05）。结论:基线25（OH）D水平和ICI疗效及irAE发生/严重程度相关,而维生素D水平不随ICI治疗后肿瘤控制而改善。因此需要评估和及时纠正患者基线维生素D水平不足/缺乏,以提高ICI疗效和减轻irAE发生/严重程度。第二部分 维生素D受体在肿瘤免疫治疗相关结肠炎患者结肠黏膜中的表达背景:VDR属于类固醇激素受体,广泛表达于多种细胞,包括结肠上皮细胞和多种免疫细胞,并参与了肿瘤、免疫性疾病、感染性疾病、内分泌及代谢性疾病等多种疾病的发病与发展。维生素D水平已被证实与ICI相关性结肠炎的发病有一定相关性。目的:本实验旨在比较ICI相关性肠炎患者和健康对照结肠黏膜VDR表达水平。方法:收集2018年6月-2021年12月于北京协和医院内镜中心行结肠镜检查的ICI相关性结肠炎患者的结肠组织石蜡标本7例及健康对照9例,以免疫组化法检测肠粘膜VDR的表达情况,并通过半定量分析法比较ICI相关性结肠炎患者和健康对照组之间的差异。结果:健康对照者结肠黏膜VDR表达丰富,广泛分布于结肠上皮细胞。ICI相关性结肠炎患者结肠组织VDR阳性表达率显著低于健康对照组（6.0±0.3 vs.8.4±0.2,P＜0.01）。结论:ICI相关性结肠炎患者结肠黏膜上皮细胞VDR表达较健康对照组患者显著下调。基础研究维生素D3/鼠李糖乳杆菌通过调节Treg细胞对小鼠ICI相关性结肠炎的保护作用第三部分 维生素D3/鼠李糖乳杆菌对小鼠ICI相关性结肠炎的保护作用及其机制研究背景:VitD缺乏患者接受肿瘤免疫治疗后更易出现高级别irAE,且ICI相关结肠炎患者结肠黏膜VDR表达量下调。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG,LGG）及其上清分泌物可促进肠上皮VDR的表达。目的:本研究旨在评估LGG/VitD3在小鼠ICI相关结肠炎中的保护作用及相关机制。方法:25只C57BL/6雄性小鼠随机分为5组（n=5）:DSS组、ICI相关肠炎模型组、LGG干预组、VitD3干预组、LGG联合VitD3干预组。DSS组建模第0天至第9天隔日腹腔注射0.9%氯化钠溶液,建模组建模第0天至第9天隔日腹腔注射PD-1抑制剂+CTLA-4抑制剂,建模第4天至第9天自由饮用含有2.5%DSS的饮用水。各干预组分别予 LGG 2.5X 10^8 CFU/d、VitD3 100IU/d、LGG2.5 X 10^8CFU/d 联合VitD3 100IU/d灌胃。通过体重、结肠长度、疾病活动指数（Disease activity index,DAI）评分及组织病理学评分来评估结肠炎的严重程度。采用qRT-PCR法检测结肠组织细胞因子表达水平,采用qRT-PCR和Western blot法测定VDR表达量,并采用免疫组化半定量评分评估结肠上皮Treg细胞数量。结果:与DSS组相比,ICI相关肠炎模型组小鼠在建模第10天体重明显下降,DAI评分显著升高（P＜0.05）,提示ICI相关性结肠炎建模成功,VDR总蛋白表达量下降（P＜0.05）。各干预组分别与ICI相关肠炎模型组相比,LGG干预组建模第10天体重下降程度、结肠长度、结肠组织病理损伤评分显著下降（P＜0.05）;VitD3干预组第10天体重下降程度、结肠组织病理损伤评分减低（P＜0.05）;LGG联合VitD3干预组结肠组织病理损伤评分减低（P＜0.05）,第10天体重下降程度有减低趋势,但未达统计学差异（P=0.05）。ICI相关肠炎模型组与DSS组相比,小鼠结肠黏膜IL-10 mRNA相对表达量升高（P=0.04）,其余各组之间IL-6 mRNA、IL-10 mRNA、TNF-α mRNA相对表达量无明显差异（P＞0.05）。各干预组与建模组之间结肠黏膜VDR表达量无明显差异（P＞0.05）。与DSS组相比,ICI相关肠炎模型组小鼠结肠Treg细胞数目无明显差异,LGG干预组（P＜0.01）Treg细胞明显增加,VitD3干预组（P=0.07）Treg细胞有增加趋势,联合干预组无明显变化。结论:LGG和VitD3单独及联合作用能一定程度减轻小鼠ICI相关性结肠炎。第四部分 鼠李糖乳杆菌对Treg细胞分化的影响背景:LGG对ICI相关性结肠炎存在一定的保护作用,但其作用机制尚且不明。其他实验发现调整肠道菌群后,ICI相关性结肠炎动物模型和患者体内调节性T细胞（T Regulatory cells,Treg）细胞数量增加且代谢功能增强,肠道炎症得到缓解。目的:本研究旨在探索体外LGG对Treg细胞分化的影响。方法:免疫磁珠分选人外周血单个核细胞CD4+na?ve T细胞,分选后的细胞用完全培养基重悬后置于抗体包被的24孔板中,将不同浓度的LGG上清液或细胞培养基分别与分选后的细胞共培养,将24孔板置于37℃温箱培养5天,流式检测CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例。结果:与培养基组相比,LGG终浓度为107CFU/mL（47.83%±5.21%vs.40.47%±3.96%,P=0.02）、108 CFU/mL（53.00%±3.78%vs.41.90%±1.66%,P=0.04）和 5X 108 CFU/mL（68.60%±1.42%vs.33.00%±3.28%,P＜0.01）三组均可显著促进na?veT细胞向Treg细胞的分化,且LGG对Treg细胞的促分化作用呈浓度依赖性,浓度为5 × 108 CFU/mL的LGG上清液促分化能力最为显著。结论:LGG上清液能促进外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的分化。