论文部分内容阅读
第一部分异种气管移植动物模型的建立目的建立一种简单的豚鼠-SD大鼠异种气管移植动物模型,为下一步研究其免疫排斥反应特点及干预措施奠定基础,为解决临床上供体气管来源问题提供新方向。方法采用“加植法”建立了一种新型的短段(5个气管环)异种原位气管移植动物模型,观察术后受体存活时间、移植气管在光镜和电镜下的病理组织学改变,初步分析其免疫排斥反应特点。结果单人操作连续进行20例异种气管移植,手术成功率达100%(20/20),受体手术时间(20.8±1.6)min,无重要手术并发症。受体术后存活最短8.0d,最长12.5d,平均(10.0±1.3)d。移植气管随着时间延长逐渐出现管腔狭窄,黏膜上皮、黏膜下、外膜及软骨逐渐出现不同程度淋巴细胞、嗜酸粒细胞、单核巨噬细胞的浸润以及细胞凋亡现象。结论以“加植法”建立的短段(5个气管环)异种气管移植动物模型,术后移植段气管的病理变化符合异种气管移植免疫排斥反应的一般特点,是一种简便、经济实用、稳定可靠和易于复制的器官移植研究动物模型。第二部分SD大鼠骨髓间充质干细胞体外培养、表型鉴定与标记目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为进一步研究MSCs干预异种气管移植的免疫排斥做好准备。方法采用直接贴壁法分离培养MSCs;通过流式细胞仪检测细胞表面标志抗原CD90、CD45的表达率对培养的MSCs进行表型鉴定;DAPI标记第3代MSCs,观察标记效率。结果体外培养的原代MSCs 48h内可见有少量贴壁细胞,7～10d左右达到90%汇合;流式细胞仪检测第3代MSCs表面标记物CD90、CD45的阳性率分别为99.8%、6.8%,提示MSCs表达CD90而不表达CD45;用DAPI进行细胞标记后,荧光显微镜下见几乎所有MSCs均已被标记蓝色荧光,提示DAPI标记法敏感性好,标记效率高。结论贴壁培养法是一种简便易行的培养MSCs方法,操作简单,成功率高,可以作为培养SD大鼠MSCs的常规方法;DAPI标记可作为标记MSCs的一种有效手段。第三部分骨髓间充质干细胞对异种气管移植免疫排斥反应的影响目的通过静脉移植的方式将骨髓间充质干细胞(MSCs)输入豚鼠-大鼠异种气管移植后的受体,进一步研究异种气管移植的排斥反应特点及MSCs对其免疫干预作用,为解决临床上气管移植术后抗排斥问题提供新思路。方法实验分成4组:A组(自体移植,n=17);B组(异种移植,n=20);C组(异种移植+CsA,n=25);D组(异种移植+MSCs,n=25)。记录受体存活时间,观察移植气管病理组织学变化及气管通畅度,流式细胞仪检测外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量的变化,移植气管冷冻标本免疫荧光检查IgG、IgM、C3的沉积,TUNEL法检测移植物细胞凋亡并计算凋亡指数(AI),生化分析仪检测外周血肌酐(CREA)的变化。结果(1)异种移植后各组受体平均存活时间分别为: B组(10.0±1.3)d、C组(17.1±2.7)d、D组(17.6±3.2)d,C、D组生存时间显著长于B组(P<0.01)。(2)各组移植气管病理积分和通畅度的比较:异种移植后的各组与自体移植组相比,病理积分显著增加(P<0.01)而通畅度显著下降(P<0.01),表现均为急性排斥改变;C、D组病理损害比B组轻,说明排斥反应被减轻。(3)外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量的比较:异种移植后的各组比自体移植组显著增加,随时间持续升高,说明T细胞被激活参与了急性免疫排斥反应;B组增加最明显,C、D组低于B组,说明细胞免疫被抑制。(4)免疫荧光检查结果比较:自体移植组未见IgG、IgM、C3的沉积,异种移植后的各组可见不同程度的IgG、IgM、C3沉积,说明体液免疫和补体系统参与了急性排斥反应;B组IgG、IgM、C3复合物沉积最明显,D组低于B组,说明MSCs对体液免疫和补体系统具有调节作用。(5)移植气管细胞凋亡的比较:自体移植组AI显著低于异种移植后的各组(P<0.01),B组移植物AI最高与C、D组比较差异有显著性(P<0.01)。(6)外周血肌酐(CREA)的比较:C组随时间的延长逐渐增加,其余3组则基本不变。结论细胞免疫、体液免疫均参与了豚鼠-大鼠异种气管移植的急性排斥反应;静脉移植MSCs可明显延长异种气管移植受体的存活时间,增加移植气管通畅度,抑制细胞凋亡,减轻免疫排斥反应;MSCs可能通过对免疫细胞和补体系统的调节等多方面因素干预免疫排斥反应;MSCs抗排斥效力与CsA相当,但没有其增加感染和损害肾功能等副作用。