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桑枝(Ramulus Mori)是桑科植物桑（Morus albaL.）的干燥嫩枝，是桑生产桑叶之外的最大副产物，其资源在中国非常丰富。桑枝是我国传统的中药材，具有祛风湿、利关节、行水之功效，临床上主要用于治疗肩臂关节及手足酸痛麻木、风湿痹痛、瘫痪等疾病。现代药理学研究证明，桑枝富含多糖、黄酮、生物碱等活性成分，具有降血糖、抗氧化、抗炎、降血脂、抗肿瘤等药理作用。多糖作为桑枝的主要活性成分，在桑枝的药理作用中发挥着重要作用，但对其分离纯化、药理作用机理以及与药理活性密切相关的结构特征等缺乏系统研究。基于以上问题，本研究对桑枝多糖的分离、纯化、一级结构特征、体外抗肿瘤作用及其机理进行了探究。主要研究方法与结果如下:
1、采用超声波辅助水提醇沉法结合Sevag除蛋白法制备桑枝粗多糖（RMP），并对RMP进行紫外全波长扫描，然后采用苯酚-硫酸法和BCA蛋白含量检测法分别测定RMP中的多糖含量和蛋白质含量，再通过MTT法检测RMP的体外抗肿瘤作用。结果表明，RMP中的多糖含量为30.27％，蛋白质含量为12.63％，与紫外全波长扫描结果一致;RMP在体外能抑制肿瘤细胞HeLa和HepG2的生长，促进正常细胞HEK-293的生长，显示出作为抗肿瘤药物或辅助治疗药物进一步研究和开发的潜力。
2、采用乙醇分级沉淀联合柱层析法，从RMP中分离纯化桑枝多糖均一组分，并采用高效排阻色谱法、苯酚-硫酸法、BCA蛋白含量检测法、间羟基联苯法、紫外全波长扫描法、红外光谱法，分析桑枝多糖均一组分的理化性质。结果发现，通过30％、60％、80％乙醇分级沉淀，从RMP中分离得到三个组分RMP30、RMP60、RMP80，联合DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换和Sephacryl S系列葡聚糖凝胶柱层析，从RMP60中分离纯化得到两个桑枝多糖均一组分RMP1和RMP2;RMP1和RMP2的均一性好、纯度高，分子量分别为1.37×105Da和5.1×103Da;RMP1和RMP2中的多糖含量分别为95.1％和94.2％，蛋白质含量分别为3.1％和4.7％，糖醛酸含量分别为8.0％和15.1％;RMP1和RMP2具有相似的红外光谱图，都显示了多糖的特征吸收峰，都含有糖醛酸基团和吡喃糖残基。
3、通过乙酰化、甲基化、核磁共振分析实验，对两个桑枝多糖均一组分RMP1和RMP2的一级结构进行探究，并推导出可能的结构式。结果表明，RMP1主要由五种单糖鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比分别为0.08∶0.56∶0.37∶0.17∶1.00，其主链主要由糖残基1,6-β-D-Galp、1，3，6-β-D-Galp和1,3-β-D-Galp组成，两个支链由糖残基1，2-α-L-Araf、1,3，6-β-D-Galp和1,4-β-D-Xylp组成，两个端基分别为α-L-Araf和β-D-Glcp;RMP2由五种单糖阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比分别为0.49∶0.26∶0.77∶1.00∶0.78，其主链主要由糖残基1，4-α-D-GalpA、1，6-α-D-Glcp、1，4-β-D-Manp和1，6-β-D-Manp组成，两个端基分别为β-D-Xylp和α-L-Araf,分别在O-4位与1,6-β-D-Manp残基和在O-6位与1，4-β-D-Manp残基相连，以组成RMP2的两个支链。
4、通过MTT实验、细胞凋亡检测、细胞周期检测、NO释放量检测和Western blotting实验等，研究了两个桑枝多糖均一组分RMP1和RMP2的体外抗肿瘤作用及其机理。结果显示，RMP1和RMP2在体外均能抑制肿瘤细胞SGC-7901和HeLa的增殖，RMP1还能抑制肿瘤细胞HepG2的生长，而RMP1和RMP2对正常细胞HEK-293和RAW264.7的生长均有一定的促进作用，表明RMP1和RMP2具有体外抗肿瘤作用，并且对正常细胞无毒性作用;RMP1和RMP2能诱导SGC-7901细胞总凋亡率增加，并将细胞阻滞在S期，表明诱导细胞凋亡和细胞S期阻滞是RMP1和RMP2抑制SGC-7901细胞生长的可能途径;RMP1和RMP2对RAW264.7细胞生长均具有体外促进作用，RMP1处理RAW264.7后导致细胞NO释放量的显著增加，说明RMP1能诱导免疫反应的发生，可能通过免疫增强作用来抑制肿瘤细胞的生长;RMP2能显著上调细胞凋亡相关蛋白Bax、Cyt C、caspase3、caspase9、caspase8、Cleaved PARP、p53以及细胞周期相关蛋白E2F1、p-Rb在SGC-7901细胞中的表达水平，显著下调细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PARP以及细胞周期相关蛋白CDK2、Cyclin E1、Cyclin A2的表达水平，表明RMP2主要通过调节线粒体介导的内源性凋亡途径诱导SGC-7901细胞凋亡以及改变细胞周期相关调控因子的蛋白表达水平将SGC-7901细胞阻滞在S期，从而实现体外抗肿瘤作用。
本研究首次从桑枝中分离纯化出两个桑枝多糖均一组分RMP1和RMP2，较详细地解析了它们的基本理化性质和一级结构特征，推导出了可能的结构式，并探究了它们的体外抗肿瘤作用及其机理。研究结果为桑枝多糖结构与功能的构效关系研究打下了基础，同时为桑枝多糖药用和保健用开发提供了理论依据。
1、采用超声波辅助水提醇沉法结合Sevag除蛋白法制备桑枝粗多糖（RMP），并对RMP进行紫外全波长扫描，然后采用苯酚-硫酸法和BCA蛋白含量检测法分别测定RMP中的多糖含量和蛋白质含量，再通过MTT法检测RMP的体外抗肿瘤作用。结果表明，RMP中的多糖含量为30.27％，蛋白质含量为12.63％，与紫外全波长扫描结果一致;RMP在体外能抑制肿瘤细胞HeLa和HepG2的生长，促进正常细胞HEK-293的生长，显示出作为抗肿瘤药物或辅助治疗药物进一步研究和开发的潜力。
2、采用乙醇分级沉淀联合柱层析法，从RMP中分离纯化桑枝多糖均一组分，并采用高效排阻色谱法、苯酚-硫酸法、BCA蛋白含量检测法、间羟基联苯法、紫外全波长扫描法、红外光谱法，分析桑枝多糖均一组分的理化性质。结果发现，通过30％、60％、80％乙醇分级沉淀，从RMP中分离得到三个组分RMP30、RMP60、RMP80，联合DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换和Sephacryl S系列葡聚糖凝胶柱层析，从RMP60中分离纯化得到两个桑枝多糖均一组分RMP1和RMP2;RMP1和RMP2的均一性好、纯度高，分子量分别为1.37×105Da和5.1×103Da;RMP1和RMP2中的多糖含量分别为95.1％和94.2％，蛋白质含量分别为3.1％和4.7％，糖醛酸含量分别为8.0％和15.1％;RMP1和RMP2具有相似的红外光谱图，都显示了多糖的特征吸收峰，都含有糖醛酸基团和吡喃糖残基。
3、通过乙酰化、甲基化、核磁共振分析实验，对两个桑枝多糖均一组分RMP1和RMP2的一级结构进行探究，并推导出可能的结构式。结果表明，RMP1主要由五种单糖鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比分别为0.08∶0.56∶0.37∶0.17∶1.00，其主链主要由糖残基1,6-β-D-Galp、1，3，6-β-D-Galp和1,3-β-D-Galp组成，两个支链由糖残基1，2-α-L-Araf、1,3，6-β-D-Galp和1,4-β-D-Xylp组成，两个端基分别为α-L-Araf和β-D-Glcp;RMP2由五种单糖阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，摩尔比分别为0.49∶0.26∶0.77∶1.00∶0.78，其主链主要由糖残基1，4-α-D-GalpA、1，6-α-D-Glcp、1，4-β-D-Manp和1，6-β-D-Manp组成，两个端基分别为β-D-Xylp和α-L-Araf,分别在O-4位与1,6-β-D-Manp残基和在O-6位与1，4-β-D-Manp残基相连，以组成RMP2的两个支链。
4、通过MTT实验、细胞凋亡检测、细胞周期检测、NO释放量检测和Western blotting实验等，研究了两个桑枝多糖均一组分RMP1和RMP2的体外抗肿瘤作用及其机理。结果显示，RMP1和RMP2在体外均能抑制肿瘤细胞SGC-7901和HeLa的增殖，RMP1还能抑制肿瘤细胞HepG2的生长，而RMP1和RMP2对正常细胞HEK-293和RAW264.7的生长均有一定的促进作用，表明RMP1和RMP2具有体外抗肿瘤作用，并且对正常细胞无毒性作用;RMP1和RMP2能诱导SGC-7901细胞总凋亡率增加，并将细胞阻滞在S期，表明诱导细胞凋亡和细胞S期阻滞是RMP1和RMP2抑制SGC-7901细胞生长的可能途径;RMP1和RMP2对RAW264.7细胞生长均具有体外促进作用，RMP1处理RAW264.7后导致细胞NO释放量的显著增加，说明RMP1能诱导免疫反应的发生，可能通过免疫增强作用来抑制肿瘤细胞的生长;RMP2能显著上调细胞凋亡相关蛋白Bax、Cyt C、caspase3、caspase9、caspase8、Cleaved PARP、p53以及细胞周期相关蛋白E2F1、p-Rb在SGC-7901细胞中的表达水平，显著下调细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、PARP以及细胞周期相关蛋白CDK2、Cyclin E1、Cyclin A2的表达水平，表明RMP2主要通过调节线粒体介导的内源性凋亡途径诱导SGC-7901细胞凋亡以及改变细胞周期相关调控因子的蛋白表达水平将SGC-7901细胞阻滞在S期，从而实现体外抗肿瘤作用。
本研究首次从桑枝中分离纯化出两个桑枝多糖均一组分RMP1和RMP2，较详细地解析了它们的基本理化性质和一级结构特征，推导出了可能的结构式，并探究了它们的体外抗肿瘤作用及其机理。研究结果为桑枝多糖结构与功能的构效关系研究打下了基础，同时为桑枝多糖药用和保健用开发提供了理论依据。