大蒜素诱导人胃癌SGC-7901细胞M期阻滞机制研究前言大蒜是百合科葱属植物蒜的鳞茎。流行病学研究已证实大蒜具有多种防病抗病功能。大蒜的有效成分主要是一些含硫有机化合物，其中较典型的一种为大蒜素。大蒜素（allicin）又名蒜素，大蒜新素，大蒜辣素，化学名二烯丙基三硫化物（diallyl trisulfide），具有抗感染，降血脂，防治动脉硬化，防止DNA损伤，提高细胞活力，提高细胞抗氧化及解毒能力等多种抗病活性。近来的研究还发现大蒜素具有良好的抗癌、防癌作用。大蒜素的抗肿瘤机制较多，其中较重要的一种是可诱导肿瘤细胞发生周期特异性阻滞。本室前期研究已发现大蒜素可使人胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803细胞周期阻滞于M期，但这种M期阻滞的机制尚不清楚。临床常用的选择性作用于M期的长春碱类抗肿瘤药物如长春新碱，是通过破坏微管动力学的稳定性，促进微管解聚，阻碍纺锤体形成而使肿瘤细胞阻滞于M期的。而这种微管动力学的稳定性又是受到有丝分裂促进因子MPF即p34^cdc2／cyclin B₁复合物通过磷酸化微管相关蛋白MAP来调节的。大蒜素是否与长春碱类药物一样，也是通过促进微管解聚来诱导肿瘤细胞M期阻滞的?它们促进微管解聚的作用是否与MPF的表达有关?这些问题尚有待研究。目的本研究采用免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜技术，观察大蒜素和长春新碱处理前后SGC-7901细胞中微管结构及cyclin B₁在胞内分布的变化，并定量分析cyclin B₁在用药前后量的改变，旨在揭示大蒜素诱导胃癌细胞M期阻滞的机制。方法采用细胞培养技术进行人胃癌细胞系SGC7901细胞的培养，以MTT比色法检测人胃癌细胞系SGC-7901细胞的增殖抑制率；采用免疫荧光染色方法，取对数生长期细胞接种于放置有洁净无菌盖玻片的6孔培养板中，分别加入IC50剂量的大蒜素或长春新碱，处理72h或24h后经α微管蛋白抗体或cyclin B₁抗体间接免疫荧光染色，在CLSM下观察并拍照。比较大蒜素处理前后M期细胞占总细胞数百分比的变化，观察细胞微管结构及cyclin B₁在胞内分布的变化，并利用Leica confocalsoftware软件定量分析cyclin B₁荧光强度在用药前后的改变。实验重复进行3次，以平均荧光强度作为该蛋白的相对表达量。结果1．大蒜素和长春新碱对SGC-7901细胞的增殖抑制作用在大蒜素IC50药物浓度（24h为7.2μg／ml，72h为20μg／ml）及长春新碱IC50药物浓度（24h为0.29μg／ml，72h为0.059μg／ml）作用下，SGC-7901细胞均有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性。2．α微管蛋白抗体免疫荧光染色经IC50剂量大蒜素和长春新碱处理72h后有丝分裂期细胞所占百分数分别为30.61％和34.92％，明显高于对照组的百分数（4.69％），有统计学意义（P＜0.05），而两处理组间无明显差别（P＞0.05）。大蒜素和长春新碱处理组细胞中出现一些多核细胞。对照组细胞呈多角形、菱形、梭形等正常形态，可以清楚地看到胞质中有完整的条状或网状微管结构。而经过大蒜素处理后的细胞与对照细胞相比大部分明显变小、变圆，胞质中正常的微管结构消失，微管蛋白或凝聚于核周，或弥漫散布。此种改变与长春新碱处理组的改变相似。3．cyclin B₁免疫荧光染色形态学及计量学观察对照组间期细胞cyclin B₁主要散布于胞质，核内较少。经IC50剂量大蒜素和长春新碱处理细胞24h后，细胞质中cyclin B₁表达升高，并向核内转移，浓聚成团。利用软件定量分析cyclin B₁蛋白荧光强度结果显示，经过大蒜素和长春新碱处理后细胞内cyclin B₁蛋白荧光强度均明显高于对照组细胞（P＜0.001），两处理组间差别（P＜0.05）远不及与对照组间那样明显。结论大蒜素诱导肿瘤细胞M期阻滞的机制与长春碱类药物相似，可以促进微管解聚，可以提高有丝分裂促进因子MPF的重要成份cyclin B₁在细胞内的表达，使细胞周期阻滞于M期。大蒜素可以作为一种新的作用于M期的抗肿瘤药物应用于临床。