帕金森病(PD)是以黑质多巴胺(DA)能神经元变形死亡为病理特征的一种神经退行性疾病,发病年龄平均为60岁。临床表现为肌强直、静止性震颤、步态和姿势不稳等运动障碍,以及失眠、抑郁等非运动症状,会严重影响老年人的健康。引发该病的因素包括遗传、环境、药物等,由这些因素导致的线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质聚集、炎症反应等是主要机制,其中线粒体功能障碍可能是重要的机制之一。线粒体是细胞的能量供给中心,同时也是生成氧自由基(ROS)的主要场所,上述因素都可能使线粒体的电子传递链功能异常而生成ROS增加。ROS对细胞产生氧化应激损伤,使DA能神经元变形死亡而引发PD。有实验证明,自噬-溶酶体系统与PD的发病有关,尤其与线粒体自噬密切相关。近年来发现,过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(PGC-1α)在剧烈运动时会高表达,并与线粒体的生物发生和细胞自噬/线粒体自噬密切相关,使其在骨骼肌细胞的重塑过程中起着重要作用。这提示,PGC-1α可能通过调节线粒体的自噬和生物发生而对细胞的损伤有保护作用。那么,如果人为提高PGC-1α的表达,能否对MPP+损伤的DA能神经元进行保护?其对细胞自噬/线粒体自噬有否影响?对在体DA能神经元的损伤有否保护作用?对胶质细胞和炎症反应有否影响?这些都是非常值得探讨的问题。对这些问题的解明将有助于确定PGC-1α能否作为防治PD的药物靶点提供必要的实验证据,具有一定的理论和实际意义。针对上述问题,本研究拟以SH-SY5Y细胞和C57BL/6小鼠为研究对象,用MPP+诱导SH-SY5Y细胞损伤复制PD细胞模型,通过腹腔注射MPTP复制C57BL/6小鼠的PD模型。首先采用MTT比色法、FJC染色法、Hoechst 33342染色法来确定MPP+对SH-SY5Y细胞的最佳损伤条件;将细胞和动物均分为CON组、MPP+(MPTP)组、NCOE+MPP+(MPTP)组和OE+MPP+(MPTP)组;在OE+MPP+(MPTP)组,用构建好的PGC-lα过表达慢病毒对SH-SY5Y细胞和小鼠中脑黑质进行转染使其过表达;通过MTT比色法检测以上四组SH-SY5Y细胞的存活率的变化,然后采用Real-time PCR来探究PGC-lα过表达后线粒体相关基因和自噬相关基因mRNA水平的变化;用免疫荧光染色法来观察中脑黑质多巴胺能神经元以及星形胶质细胞和小胶质细胞的表达变化,从而为上述问题寻找答案。实验所得结果如下:1.当mpp+的浓度为1mmol/l,对细胞作用时间为24h时,细胞存活率接近50%,所以mpp+的使用浓度1mmol/l作用24h为mpp+损伤的最适建模条件。2.通过fjc染色法、hoechst33342染色法检测mpp+对sh-sy5y细胞不同时间点的损伤发现,随着与mpp+孵育时间的增加,细胞的凋亡率逐渐增加,说明mpp+损伤与孵育时间成正相关,由以上两个实验结果综合考虑mpp+的损伤时间为24h,浓度为1mmol/l。3.利用pcr技术获取目的基因后与线性载体进行连接,转化,对阳性转化子进行pcr鉴定,测序后与目的基因进行比对得出重组质粒的测序结果和目标序列一致,获得过表达载体。4.elisa法滴度检测ncoe和oe病毒的滴度分别为1×109tu/ml和2×108tu/ml。5.通过mtt比色法测定pgc-1α过表达后细胞存活率,发现pgc-1α过表达后,细胞的存活率明显上升。ncoe组较正常组无显著性差异。oe组细胞的存活率较各组均有明显升高的趋势,且与mpp+组和ncoe组比具有极显著的差异(p<0.01),和con组相比具有显著性差异(p<0.05)。6.real-timepcr检测线粒体相关基因(nrf1、drp1、mfn2)、自噬相关基因(lc3b、p62)的表达变化。发现pgc-1α过表达后,nrf1mrna的表达也显著升高,且与mpp+组和ncoe组比较均有极显著差异(p<0.01)。而线粒体分裂、融合基因drp1和mfn2的mrna表达也明显升高。oe组drp1较mpp+组具有极显著差异(p<0.01)与ncoe组相比无统计学差异。mfn2mrna的表达较mpp+组和ncoe组比较均有极显著差异(p<0.01)。自噬相关基因lc3b的mrna表达明显降低,且与mpp+组和ncoe组比较均有极显著差异(p<0.01)。p62mrna的表达明显升高,且与mpp+组和ncoe组比较均有极显著差异(p<0.01)。7.对小鼠进行黑质立体定位注射pgc-lα过表达慢病毒基因干预后,统计结果表明,小鼠中脑黑质致密部多巴胺能神经元的数量没有明显的改善,th阳性神经元的表达各组之间无统计差异。免疫荧光检测pgc-1α的表达变化发现oe组pgc-1α阳性细胞数较mptp组和ncoe组均有明显增多的趋势,且具有极显著差异(p<0.01)。尤其是在黑质的致密部,pgc-1α阳性细胞数明显增多。虽然在细胞数上pgc-1α的表达是升高的,但是,由免疫荧光图片我们可观察到pgc-1α形态较为异常,细胞变得不规则。此外,免疫荧光统计结果也显示了,小胶质细胞和星形胶质细胞出现了过度激增的现象。通过对上述实验结果的分析,得出如下结论:1.本研究检测所得1 mmol/L的MPP+对SH-SY5Y细胞损伤24 h为MPP+的最适建模条件。可成功复制出MPP+诱导的PD体外模型。2.PD细胞模型中,过表达PGC-lα可以抵抗MPP+诱导的细胞毒性,抑制自噬的发生,增加MPP+损伤后NRF1的表达,提高线粒体融合基因Mfn2的表达对于改善线粒体功能,维护线粒体分裂融合的动态平衡起到了一定的作用,从而减少细胞的凋亡,进而对细胞产生一定的保护作用。3.PD动物模型中,PGC-1α过表达会引发黑质处星形胶质细胞和小胶质细胞的激增,对动物体产生二次损伤的作用,因而对多巴胺能神经元可能是一种损伤作用。本研究结果为后继进一步探讨PGC-1α作为防治PD的药物靶点提供了基础。