背景肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)过度沉积的病理过程,它不是一个独立的疾病,许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化,其发病率和病死率位均居全球前列。肝纤维化既是各种慢性肝病发展的共同结果,又是肝硬化的必经阶段,更是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的前兆。引起肝纤维化的因素包括肝炎病毒、慢性酒精中毒、非酒精性脂肪性肝炎、药物、工业毒物、肝静脉回流受阻、血吸虫病、自身免疫性肝炎、胆汁淤积、遗传代谢疾病和隐源性肝炎等。我国是病毒性肝炎高发国家,全球有慢性乙型肝炎病毒感染者约3.5亿,丙型肝炎病毒感染者1.7亿,而其中我国约有1.2亿HBV和400万HCV感染者。慢性乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染引起慢性肝脏炎症,促进了肝纤维化,进一步发展成肝硬化,从而大大增加了发生肝细胞癌的风险,相关研究显示超过85%的肝细胞癌与慢性HCV、HBV感染有关。在目前尚无有效方法根治原发疾病的情况下,深入的研究肝纤维化形成和发展的分子机制,寻找相应的特异性治疗靶点,以阻止或逆转纤维化的进展,从而防止其进一步发展为肝硬化、甚至肝癌,便成为十分重要的治疗目标。肝纤维化发病机制的相关研究显示肝星状细胞(HSC)激活与转化是肝脏纤维化形成的关键。而转化生长因子-β1(Transforming growth factor beta-β1)在肝脏纤维化形成的过程中起着非常重要的作用。TGF-β1是促进HSC活化,并促进HSC表达ECM的关键因子。TGF-β1能促进HSC合成弹性蛋白、粘着蛋白、胶原及蛋白聚糖等细胞外基质,减少降解蛋白酶的合成,从而阻止新合成ECM的分解,打破了ECM合成与降解的平衡,使ECM的沉积增多,加速肝脏纤维化的发展。TGF-β1的促纤维化作用主要通过下游Smads家族传递信号,相关研究表明TGF-β/Smad信号途径在肝纤维化的发病机制中发挥了关键作用。此外,除了Smad信号,TGF-β1还可以激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号转导通路,主要包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)和p38激酶三个亚族。我们前期的研究结果表明在HepG2细胞中TGF-β1有可能通过JNK和p38信号途径促进了Smad2/3、Smad3L的磷酸化。在此基础之上,本课题将继续研究MAPK通路对TGF-β1/Smad信号转导的其他重要环节调控的作用机制。目的1.阐明HepG2细胞内MAPK通路对TGF-β1/Smad信号转导的调控作用；2.阐明HSC细胞内MAPK通路对TGF-β1/Smad信号转导的调控作角。方法1.细胞培养与处理HSC细胞或HepG2细胞在无血清培养基培养24h,加或不加三种MAPK抑制因子(ERK抑制因子PD98059、JNK抑制因子SP600125、p38抑制因子SB203580)共培养5h；然后根据不同的实验,加入不同浓度的TGF-β1,不同的刺激时间；对照组加入等量的溶媒。本课题中各实验至少重复三次。2.免疫沉淀与western blot法检测HSC细胞或HepG2细胞内Smad2/3磷酸化以及Smad2/3/4复合物的表达培养结束后提取HSC细胞或HepG2细胞总蛋白,细胞提取物中加入抗-Smad2/3抗体进行免疫沉淀,随后分别利用针对Smad2/3连接区和C-末端磷酸化位点的特异性抗体：抗-pSmad3C、抗-pSmad3L、抗-pSmad2C、抗-pSmad2L),检测细胞内Smad2/3连接区和C-末端磷酸化水平；并利用抗-Smad4抗体检测与Smad2/3结合的Smad4,即Smad2/3/4复合物,以细胞内Smad2/3蛋白和细胞提取物中的Smad4蛋白作为参照。3.细胞免疫荧光染色法检测HSC细胞或HepG2细胞内磷酸化Smad2/3及MAPKs蛋白的细胞内定位表达HSC细胞或HepG2细胞接种于24孔板内的无菌玻片上,培养结束后取出细胞玻片进行固定、封闭,分别与相应的抗体孵育过夜,然后再与荧光标记的二抗孵育,在荧光显微镜下观察磷酸化Smad2/3以及MAPKs蛋白的细胞内定位表达并拍照。4Western blot法检测HSC细胞或HepG2细胞内Jmp7/Imp8和MAPKs蛋白表达培养结束后提取HepG2细胞或HSC细胞总蛋白,采用western blot法,以非磷酸化ERK1/2, JNK1/2, pp38为参照,检测细胞内pERK1/2, pJNK1/2, pp38表达；以GAPDH为内参,检测细胞内Imp7/Imp8蛋白表达水平。5.实时定量RT-PCR法HHSC细胞或HepG2细胞内PAI-1mRNA水平培养结束后提取HepG2细胞或HSC细胞的总RNA,逆转录为cDNA后,分别利用各自引物进行内参基因β-actin和靶基因PAI-1的SYBR Green I实时定量PCR反应,利用循环阈值(Threshold cycles, CT)计算PAI-1mRNA的相对表达量,以β-actin为内参；根据融解曲线确定扩增反应特异性。结果1.三种MAPK抑制因子对TGF-β,诱导的HSC细胞磷酸化Smad3L蛋白表达和转位的影响在无TGF-β1刺激条件下,Smad3C、Smad3L磷酸化程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Smad3L磷酸化,并促进pSmad3L入核；三种MAPK抑制因子(10μM)均可抑伟pSmad3L磷酸化。JNK抑制因子可抑制JpSmad3L入核。2.三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导的HSC细胞中Smad4细胞内定位的影响TGF-β1可诱导Smad4表达增加,并促进其入核；三种MAPK抑制因子均可抑制Smad4入核,但对其表达无显著影响。3Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-p,诱导HSC细胞内Imp7/Imp8蛋白表达的影响3.1Western blot去检测三种MAPK抑制因子对TGF-β,诱导HSC细胞内Imp7蛋白表达的影响在无TGF-β1刺激条件下,Imp7蛋白表达程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Imp7表达及入核；三种MAPK抑制因子均可抑制Imp7表达及入核。3.2Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导HSC细胞内Imp8蛋白表达的影响在无TGF-β1刺激条件下,Imp8蛋白表达程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Imp8表达及入核；三种抑制因子均可抑制Imp8表达,p38抑制因子可减少Imp8入核。4.三种MAPK抑制因子对TGF-p,诱导的HSC细胞内PAI-1mRNA表达的影响TGF-β1可明显诱导PAI-1mRNA表达,ERK、JNK及p38抑制因子均能抑制TGF-p1诱导的PAI-1mmRNA表达。5.三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导的HepG2细胞内MAPK通路活化的抑制作用5.1ERK抑制因子(PD98059)对TGF-β1诱导的HepG2细胞内ERK通路活化的抑制作用在无TGF-β1刺激时,HepG2细胞内的ERK通路已有一定程度磷酸化；TGF-β1则进一步增强pERK的表达。而ERK抑制因子(PD98059)可明显抑制pERK的表达。5.2JNK抑制因子(SP600125)对TGF-β1,诱导的HepG2细胞内JNK通路活化的抑制作用在无TGF-β1刺激时,HepG2细胞内的JNK通路已存在明显磷酸化；TGF-β1则进一步增强pJNK的表达。而JNK抑制因子(SP600125)可明显抑制pJNK的表达。5.3p38抑制因子(SB203580)对TGF-β,诱导的HepG2细胞内p38通路活化的抑制作用在无TGF-β1刺激时,HepG2细胞内的JNK通路已存在明显磷酸化；TGF-β1则进一步增强pp38的表达。而p38抑制因子(SB203580)可明显抑制pp38的表达。6.三种MAPK抑制因子对HepG2细胞内TGFβp1诱导的磷酸化Smad3C、Smad3L转位的影响在无TGF-p1刺激条件下,Smad3C及Smad3L磷酸化程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Smad3C、Smad3L磷酸化,并促进pSmad3C、pSmad3L入核。ERK抑制因子、JNK抑制因子显著可抑制Smad3L磷酸化及其入核,p38抑制因子抑制Smad3L磷酸化,但对其核浆分布无明显影响。TGF-β1及三种MAPK抑制因子对Smad3C磷酸化均未见显著影响,但TGF-β1增加pSmad3C入核,三种MAPK抑制因子可抑制pSmad3C入核。7.三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导HepG2细胞内Smad2/3/4复合物形成的影响在无TGF-β1刺激的对照组HepG2细胞中,无Smad2/3/4复合物形成,TGF-β1可显著诱导Smad2/3/4复合物形成；p38抑制因子(SB203580)几乎完全阻断Smad2/3/4复合物的形成；JNK抑制因子(SP600125)呈浓度依赖性抑制TGF-β1诱导的S1mad2/3/4复合物形成；ERK抑制因子(PD98059)对复合物形成没有明显影响。各组HepG2细胞内Smad2/3蛋白的表达量没有变化,同时细胞提取物中Smad4蛋白的表达量在各组间也没有差异。8.Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导HepG2细胞内Imp7/Imp8蛋白表达的影响8.1Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-β,诱导HepG2细胞内Imp7蛋白表达的影响在无TGF-β1刺激条件下,Imp7蛋白表达程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Imp7表达及入核；三种MAPK抑制因子均可抑制Imp7入核,尤其是p38抑制因子。8.2Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-β1,诱导HepG2细胞内Imp8蛋白表达的影响在无TGF-β1刺激条件下,Imp8蛋白表达程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Imp8表达及入核。ERK抑制因子、JNK抑制因子可抑制Imp8入核,p38抑制因子对Imp8核浆分布无明显影响。9.三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导的HepG2细胞内PAI-1mRNA表达的影响TGF-β1可明显诱导PAI-1mRNA表达,ERK、JNK及p38抑制因子均能抑制TGF-β1诱导的PAI-1mRNA表达。结论5.1TGF-β1诱导HSC细胞及HepG2细胞中Smad3C及Smad3L磷酸化、进而促进Smad2/3/4复合物形成及其转位入核和靶基因PAI-1mmRNA表达可能是肝纤维化-肝癌发病的重要机制,而其中TGF-β1诱导的Smad3L的磷酸化可能是肝纤维化-肝癌发病的最关键环节。5.2在HSC细胞中ERK、.INK、P38抑制因子均可明显抑制TGF-p1诱导pSmad3L的表达,JNK抑制因子可抑制pSmad3L入核；提示,Smad3蛋白连接区的磷酸化依赖于ERK、JNK、p38通路的激活,而pSmad3L转位入核则主要与JNK通路的激活有关。而在HepG2细胞中ERK抑制因子、JNK抑制因子显著可抑制Smad3L磷酸化及其转位入核,p38抑制因子抑制Smad3L磷酸化,但对其核浆分布无明显影响。三种MAPK抑制因子均可抑制pSmad3C转位入核。提示,在HepG2细胞中Smad3L磷酸化依赖于ERK、JNK、p38通路的激活,而pSmad3L转位入核则主要与ERK、JNK通路的激活有关。pSmad3C的转位入核则与ERK、JNK、p38通路的激活有关。5.3在HSC细胞中三种MAPK抑制因子均可抑制Smad2/3/4复合物入核,但对其表达无显著影响。提示,在HSC细胞中Smad2/3/4复合物的形成主要受p38、ERK通路的调控,而Smad2/3/4复合物的转位入核主要受到JNK通路的调控。而在HepG2细胞中p38抑制因子(SB203580)几乎完全阻断Smad2/3/4复合物的形成；JNK抑制因子(SP600125)呈浓度依赖性抑制TGF-β1诱导的Smad2/3/4复合物形成；ERK抑制因子(PD98059)对复合物形成没有明显影响。提示,在HepG2细胞中Smad2/3/4复合物的形成主要受p38、JNK通路的调控,而Smad2/3/4复合物的转位入核主要受到ERK、JNK通路的调控。5.4在HSC细胞中,三种MAPK抑制因子均可抑制Imp7表达及入核。三种抑制因子均可抑制Imp8表达,p38抑制因子可减少Imp8入核。提示,在HSC细胞中ERK、JNK通路对Smad2/3/4复合物的转位入核的调控可能与Imp7/Imp8的表达及Imp7的入核有关；而p38通路对Smad2/3/4复合物的转位入核的调控可能与Imp7/Imp8表达及入核有关。而在HepG2细胞中,三种MAPK抑制因子均可抑制Imp7入核,尤其是p38抑制因子。ERK抑制因子、JNK抑制因子可抑制Imp8入核,p38抑制因子对Imp8核浆分布无明显影响。提示,在HepG2细胞中,ERK、.JNK通路对Smad2/3/4复合物的转位入核的调控可能与Imp7/Imp8的入核有关；p38通路对Smad2/3/4复合物的转位入核的调控可能与Imp7的入核有关。5.5ERK、JNK、P38抑制因子均能明显抑制HSC细胞内TGF-β1诱导的靶基因PAI-lmRNA的表达。提示,ERK、JNK、p38通路均参与HSC细胞内TGF-p1信号通路靶基因PAI-1转录活性的调控。ERK、JNK、P38抑制因子均能明显抑制HepG2内TGF-β1诱导的靶基因PAI-1mRNA的表达。提示,ERK、JNK、p38通路均参与HepG2内TGF-β1信号通路靶基因PAI-1转录活性的调控。总之,在HSC细胞内p38、ERK通路可能主要通过调控Smad3蛋白连接区的磷酸化及Smad2/3/4复合物的形成而影响靶基因PAI-1的转录,JNK通路主要通过调控Smad2/3/4复合物的转位入核影响靶基因PAI-1转录。而在HepG2细胞内p38通路可能主要通过调控Smad3蛋白连接区的磷酸化及Smad2/3/4复合物的形成而影响靶基因PAI-1的转录；ERK通路主要通过调控Smad2/3/4复合物的转位入核影响靶基因PAI-I转录；JNK通路可能通过调控Smad3蛋白连接区的磷酸化及Smad2/3/4复合物的形成及调控Smad2/3/4复合物的转位入核影响靶基因PAI-1转录。