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目的:研究模拟重力加压状态下成骨的效应机制,观察“调和气血法”调控成骨的作用效果。
方法:1、动物实验部分:通过1月龄大鼠双前肢离断术和抬高饲料槽和饮水瓶的方法,训练、诱导大鼠直立,建立了大鼠长期直立负重模型,进行术后5,7,9个月观察。在每个观察点前一月灌胃给予具有“调和气血法”效果的复方芪麝片(公斤体重法换算,1次/天)。运用micro-CT、形态学染色、免疫组织化学法、real time RT-PCR等技术方法检测腰椎和软骨终板成骨指标。2、细胞实验部分:将前成骨细胞OCT-1接种在琼脂糖上,使细胞终密度2×107个/ml,琼脂糖终浓度1%,采用“模拟重力加压法”,对上述细胞施加5g和23g的压力,分别加压1天,3天和5天(3h×1次/天)。治疗组给予50umol/L黄芪甲苷。运用HE染色、ALP染色、Col I免疫荧光染色、real time RT-PCR等技术方法检测OCT-1相关成骨指标。
结果:1、动物实验部分:各组诱导直立大鼠椎体骨小梁数目均增加,厚度不变,成骨细胞数目增加,活性增强;9月组腰椎软骨终板钙化层增厚,椎体边缘一椎间盘软骨终析连接处骨质增生明显,部分细胞由外层纤维环移行而来。各组腰椎软骨终板附近和9月组椎体边缘Col I、ColX、VEGF、TGF-β1表达均增强:real-time RT-PCR示椎体、椎体边缘-椎间盘组织上述基因表达均较术前上调。复方芪麝片组椎体形态学改变类似模型组,7月用药组椎体的Colla2、TGF-β1、Runx2表达都较模型组显著上调;9月用药组椎体边缘-椎间盘连接处骨质增生不明显,Co110α1和Runx2基因表达下调。2、细胞实验部分:离心加压后OCT-1细胞Col I表达增强,1天5g压力下,ALP、OC基因表达上调,23g压力下无显著差异;5天各加压组ALP、OC基因表达均上调,ALP和Col I染色也均增强,以23g更显著。1天用药组Col I阳性染色均增强,但ALP、Collα2、OC基因表达均下调。3天用药组ALP染色阳性颗粒均增大,数量增加;除5g外,Col I阳性染色均增强,ALP、Collα2、OC基因表达均上调。5天用药组除23g外,ALP和Col I染色也均增强,ALP、Collα2、OC基因表达均上调。
结论:长期直立体位促进大鼠腰椎椎体骨形成,在早期(5月)已经显著,并能诱导椎体边缘-椎间盘软骨终板连接处骨质增生,后期(9月)更明显。复方芪麝片既能促进中后期直立模型大鼠椎体成骨,又能延缓后期直立模型大鼠椎体骨质增生的发生。“离心加压法”1d5g和5d23g对OCT-1细胞成骨效应显著,黄芪甲苷有持续促成骨作用,联合离心加压后,以3d23gAsIV和5d5gAsIV效应显著。