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副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种棒状的存在于海水中的革兰氏阴性菌,是一种极容易污染海产品的病原微生物。其编码的不耐热溶血毒素TLH是一种广泛存在于其体内的毒素蛋白,可作为检测副溶血弧菌的靶标。绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)是一个由11个β折叠通过loop环连接形成的一个桶装结构的蛋白质,在其loop结构上可以进行外源基因的插入形成新的重组蛋白。本研究是利用已获得的一个抗TLH的单链抗体的不同作用区的片段基因插入到GFP的loop 5中,并通过体外进化的方法对HCDR3进行突变得到了更高亲和力的针对TLH的抗体。本研究的主要内容包括三个方面:首先是把不同的抗体片段基因(LCDR3,HCDR3,VL VH和scFv)插入到GFP的loop 5位置中,检测不同片段的插入所形成的5种重组抗体对抗原TLH的识别作用。结果发现在loop 5位置引入LCDR3和HCDR3后,重组抗体蛋白仍然保持绿色荧光特性同时对TLH有特异性结合作用,而VL,VH和scFv的插入后形成的重组抗体蛋白则既无荧光特性也对TLH没有明显的识别作用。其次是对HCDR3进行突变以得到更高亲和力的重组抗体。先是通过Ala-scanning的方法对HCDR3的11个氨基酸进行丙氨酸突变,检测丙氨酸突变体的抗原结合活性。ELISA结果表明,HCDR3的L/A,D1/A,Y1/A,W/A,Y2/A,F/A,和D2/A氨基酸突变后抗体的亲和力明显下降。同时我们通过对这些关键氨基酸进行赖氨酸突变,发现了第4个氨基酸突变为赖氨酸之后,突变体的亲和力作用明显增加。从而得到了一个具有更高亲和力的突变体。最后是通过对loop 5和loop 9两个loop同时引入CDR3,构建四种组合形式的CDR3双插入情况,结果发现双插入的重组抗体蛋白活性明显高于单插入CDR3的重组蛋白,同时确定双插入5LCDR3和9LCDR3的亲和力是最高的。根据本实验室已研究的LCDR3的最佳突变体情况,同时对loop 5和loop 9位置上的LCDR3进行双突变,得到了一个较高亲和力的重组抗体。本研究通过GFP蛋白作为骨架,融合抗体的不同片段基因,发现在GFP的loop结构中引入CDR后重组抗体仍然具有针对相应抗原的特异性识别作用,并且通过对其HCDR3进行突变,得到了较原来更好的重组抗体。通过双插入的研究获得了具有更高亲和力的抗体。本研究提供了一种提高抗体的亲和力的新思路,同时利用GFP骨架解决了基因工程抗体原核表达的难溶性问题。