花生疮痂病(Elsino?arachidis)是我国花生产业中的重要病害,在辽宁、山东和福建等多个花生产区均有发生。该病害发生普遍,危害严重,已成为花生产业健康发展中亟待解决的植保问题。目前国内研究主要集中在病原学、发生调查、传播特性和化学防治等领域,由于缺乏基因组信息和分子研究平台,因而花生疮痂病菌在致病机制、毒素生物合成途径及调控网络等方面尚未见系统研究。突变体分析技术是研究病菌与寄主互作、致病机制和遗传进化的有效工具。本文通过紫外诱变构建了花生疮痂病菌突变体库,筛选出多株致病力变异菌株,并系统开展了生物学特性、毒力次生代谢、侵染过程及重测序研究,研究结果为花生疮痂病菌毒素生物合成途径和调控网络研究提供了研究材料,为致病机制、抗病育种和防控策略创新奠定了理论基础。主要研究结果如下:1.花生疮痂病菌突变体库的构建及其突变体特性研究通过紫外诱变建立了花生疮痂病菌突变体库,并对形态变异且遗传稳定的突变体开展了表型特性、分子特性和毒素积累及致病力研究。共获得突变体1190株,其中与野生株(WT)表型差异360株。从遗传稳定的群体中挑选22个典型的突变体作为研究材料。生物学研究表明,花生疮痂病菌菌落颜色多为红色或橘红色,生长速率为0.65 mm/d,而突变体菌落颜色丰富多样,从黄色、橘红色、红色、褐色到黑色不等,生长速率为0.23~0.71 mm/d。突变体毒素积累量明显不同,其中2个突变体产毒量显著提高,分别是WT的2倍和1.5倍,8个突变体产毒量不同程度地降低,9个突变体未检测到毒素。突变体致病力也发生丰富的变异,其中有8个突变体未见病斑。分子特性研究表明,供试突变体存在丰富的种内遗传多样性,在遗传相似系数为0.83时可分为6个遗传谱系。花生疮痂病菌突变体库的构建和特性研究为后续该病菌的致病机制、毒素生物合成途径和调控网络研究提供了丰富的研究材料。2.致病变异菌株的生物学特性和次生代谢研究在明确突变体致病力差异的基础上,系统开展了致病变异菌株SaSp-4和SaUv-62的生物学特性和次生代谢研究,结果表明,菌株生长最适温度均为25℃,最适氮源均为酵母浸粉。突变体SaUv-62菌落在光暗培养条件下均呈黑色,气生菌丝不发达,最适pH为4,最适碳源为半乳糖,菌落生长缓慢,生长速率仅为0.50 mm/d。突变体SaSp-4在黑暗条件下菌落呈黑色,而在光照条件下菌落先黑色后期呈粉红色,最适pH为6,最适碳源为葡萄糖,菌落生长较WT株(0.65 mm/d)明显变快,生长速率为0.75 mm/d。菌株在毒力相关次生代谢差异显著,在PD液体培养4周时,SaUv-62检测到胞内黑色素,但未见胞外黑色素和ESC毒素,SaSp-4产生胞内和胞外黑色素,而WT仅检测到ESC毒素,未见胞内和胞外黑色素。3.致病变异菌株的侵染过程及细胞外基质分析利用光学显微镜和扫描电镜观察研究了致病变异菌株SaSp-4和SaUv-62及WT株的侵染过程中分生孢子形态、潜育期和病叶率的变化。结果发现,花生疮痂病菌分生孢子萌发产生芽管,顶端产生类似附着胞的结构,通过气孔或表皮侵染叶片。强致病菌株SaSp-4潜育期仅为60 h,发病率100%,弱致病菌株SaUv-62潜育期为144 h,发病率仅为10%,而WT的潜育期为96 h,发病率为70%。供试菌株分生孢子形态及颜色无明显差异,均为椭圆形单胞,透明无色,但SaSp-4和SaUv-62随着接种时间延长分生孢子较野生株颜色明显加深,呈褐色,细胞壁加厚。在扫描电镜观察过程中发现,SaSp-4和SaUv-62分生孢子萌发侵染过程中与叶片接触面均有纤丝状结构,通过胞外基质成分特有染色剂分析,明确花生疮痂病菌分生孢子可分泌粘液类物质帮助病菌在侵染过程中粘附和固定,该物质成分主要为淀粉类碳水化合物和疏水蛋白。4.弱致病突变体SaUv-62的基因组重测序分析利用PacBioRSII测序技术对弱致病突变体SaUv-62进行了全基因组重测序分析,对差异基因进行检测和功能注释。结果表明,SaUv-62共获得了4,267,158条可靠的reads,与花生疮痂病菌参考基因组的覆盖度为97.37%。通过与参考基因组比对,检测到SaUv-62的单核苷酸多态性(SNP)变异共5660个,发生在非编码区的SNP有5605个,发生在编码区的SNP有55个,其中同义SNP突变有16个,非同义SNP突变有39个,共导致37个基因变异。SaUv-62的小片段插入与缺失(InDel)共84个,发生在非编码区的有77个,发生在编码区的有7个,其中移码突变4个,密码子插入2个,密码子删除1个,共导致7个基因发生变异。参考GO、COG和KEGG等数据库,共有44个变异基因被注释得到,分别参与核苷酸、氨基酸、碳水化合物等初级代谢(5个,EVM0000446、EVM0009002、EVM0005327、EVM0000789和EVM0001172)、次生代谢产物生物合成和分解代谢(1个,EVM0002494)以及信号转导(4个,EVM0000248、EVM0005690、EVM0002912和EVM0005538)和遗传信息处理(2个,EVM0005202和EVM0005327)等多个生物功能。SaUv-62重测序分析为花生疮痂病菌致病相关、毒素生物合成与代谢等基因的筛选与鉴定提供分子信息和理论基础。