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第一部分mi R-221/222的表达与多发性骨髓瘤对地塞米松的敏感性相关目的:探讨mi R-221/222在多发性骨髓瘤(MM)细胞中的表达情况及其意义。方法:采用q RT-PCR的方法检测MM患者、正常对照骨髓CD138+细胞中mi R-221/222的表达量,并分析其临床相关性;采用q RT-PCR的方法检测多个MM细胞系中mi R-221/222的表达量,并通过CCK-8的方法检测各种MM细胞对地塞米松的敏感性,分析mi R-221/222与地塞米松敏感性的相关性。采用瞬时转染方法将agomir-221-222转染mi R-221/222低表达的MM细胞,将antagomir-221/222转染mi R-221/222高表达的MM细胞,并使用CCK-8的方法检测转染后的细胞对地塞米松敏感性变化。结果:mi R-221/222在MM患者的骨髓浆细胞中的表达明显高于正常对照,且在复发耐药的MM患者中的表达明显高于初诊的MM患者(p<0.001);细胞系MM.1S,U266,JJN3,RPMI-8226对地塞米松相对敏感,而细胞系MM.1R,ARH-7,H929,MR-20对地塞米松相对耐药;与地塞米松耐药的细胞系相比,地塞米松敏感的细胞mi R-221/222的表达水平较低(p<0.05);过表达mi R-221/222可减低MM细胞对地塞米松的敏感性,抑制mi R-221/222的表达可增加MM细胞对地塞米松的敏感性(p<0.01)。结论:mi R-221/222在MM细胞中的表达具有明显的异质性,其表达与MM细胞对地米的敏感性呈负相关。第二部分地塞米松引起多发性骨髓瘤细胞发生致死性自噬目的:探讨自噬在地塞米松引起的多发性骨髓瘤(MM)细胞死亡中的作用。方法:采用透射电镜检测自噬泡、western blotting检测自噬相关蛋白、以及激光共聚焦检测GFP-mcherry-LC3B表达细胞荧光表达的方法观察地塞米松作用于骨髓瘤细胞MM.1S和MM.1R后自噬水平的变化。采用western blotting以及CCK-8的方法分别检测自噬抑制剂3-MA或LY294002与地塞米松共同作用后自噬的变化以及细胞死亡的变化。结果:地塞米松作用后,激素敏感的MM细胞系的自噬水平明显增加,而激素耐药的MM细胞系自噬水平无明显作用;自噬抑制剂3-MA或LY294002与地塞米松同时作用于激素敏感的MM细胞后,可以部分抑制地塞米松所引起的自噬增高,表现为LCB-II的减少和p62的增多,同时可以抑制地塞米松引起的细胞死亡(p<0.01)。结论:地塞米松引起MM细胞发生促死亡的自噬,自噬的抑制导致地塞米松的耐药。第三部分mi R-221/222靶向ATG12和p27-m TOR通路抑制自噬目的:探讨mi R-221/222及其靶基因的表达水平与细胞自噬水平的关系。方法:采用生物信息学方法对mi R-221/222的靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告实验对靶基因进行验证。采用q RT-PCR和western blotting的方法检测MM患者、MM细胞系ATG12、p27 m RNA和蛋白的表达水平,分析ATG12和p27与mi R-221/222表达的相关性;将agomir-221-222、antagomir-221/222、ATG12si RNA或p27 si RNA转染MM细胞,并采用western blotting的方法检测细胞转染后ATG12、p27、pm TOR、m TOR、LC3B、p62蛋白的表达,以及激光共聚焦检测GFP-mcherry-LC3B表达细胞中点状荧光情况;结果:生物信息学软件预测ATG12、p27可能为mi R-221/222的靶基因;双荧光素酶报告实验证实ATG12为mi R-221/222的靶基因;在MM中,mi R-221/222的表达与ATG12、p27 m RNA的表达呈负相关,并可以反向调控ATG12、p27的表达;Agomir-221/222和antagomir-221/222分别抑制和促进MM细胞自噬水平;敲除ATG12或者p27可抑制自噬的水平,并可抑制antagomir-221/222所致的自噬水平的增加。结论:ATG12和p27为mi R-221/222的靶基因,且在MM细胞中受mi R-221/222的调节;ATG12和p27促进自噬,mi R-221/222通过抑制ATG12和p27抑制自噬水平。第四部分抑制mi R-221/222诱导MM细胞发生自噬性死亡目的:探讨mi R-221/222调节自噬在MM地塞米松耐药中的作用。方法:采用q RT-PCR和western blotting的方法分别检测地塞米松体外作用于MM细胞前后mi R-221/222,ATG12、p27、m TOR、pm TOR、p62的表达水平;分别皮下注射MM.1S和MM.1R细胞构建激素敏感和激素耐药的皮下移植瘤鼠模型,记录地塞米松作用后皮下瘤生长情况,并采用q RT-PCR和western blotting的方法检测瘤体mi R-221/222,ATG12、p27、p62的表达水平;敲低MM.1S细胞和antagomir-221/222转染后的MM.1R细胞的ATG12和p27的表达,利用western blotting检测在地塞米松作用后细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspases-3和cleaved PARP的表达,CCK-8检测细胞死亡情况;采用瘤内注射antagomir-221/222和腹腔注射地塞米松联合治疗MM.1R-皮下移植瘤模型小鼠,记录治疗后皮下瘤生长情况反应治疗效用,采用western blotting、免疫组化的方法检测下调mi R-221/222后ATG12、p27、p62、Beclin-1、LC3B的表达水平。结果:体、内外实验均表明,相比于MM.1R细胞,mi R-221/222在MM.1S细胞中不仅基础表达量低,而且地塞米松作用后可使MM.1S细胞的mi R-221/222的表达进一步减少,伴随着ATG12和p27表达增多,磷酸化的pm TOR蛋白和p62蛋白表达减少,而对MM.1R细胞无明显作用。地塞米松可以引起MM.1S细胞发生凋亡表现为cleaved caspases-3和cleaved PARP增多,敲低ATG12和p27可以抑制地塞米松引起的细胞死亡,不能抑制凋亡cleaved caspases-3和cleaved PARP;Antagomir-221/222和地塞米松作用后,MM.1R细胞的cleaved caspases-3和cleaved PARP增多,敲低ATG12和p27可以抑制Antagomir-221/222和地塞米松同时作用后引起的MM.1R细胞的死亡,但不能抑制cleaved caspases-3和cleaved PARP的表达;在体内,Antagomir-221/222和地塞米松联合治疗可以抑制瘤体生长(p<0.01),并激活ATG12/p27-m TOR自噬性死亡途径。结论:地塞米松通过抑制mi R-221/222激活ATG12/p27-m TOR引起MM细胞的自噬性死亡;靶向mi R-221/222,诱导自噬性死亡可以部分逆转MM细胞地塞米松耐药。