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金柑属（Fortunella）植物属于芸香科（Rutaceae）柑橘亚科（Aurantioideae）柑橘族（Citreae）中的真正柑橘类植物,是柑橘属植物的近缘属植物,是著名的经济类果树之一,也是我国特有的果树资源。金柑果实果皮味甜,整果可以鲜食,同时可以广泛用于制造果脯、果酱、果汁饮料等休闲食品,具有重要的营养和经济价值。此外,金柑果实还具有特殊的药用保健功效,古籍早有记载金柑具有止咳、化痰、防治感冒等功效,现代科学研究表明金柑含有多种生物活性物质,如类黄酮、柠檬苦素、多糖等,并被报道有抗氧化、抗炎等生物活性。心脑血管疾病和癌症是威胁人类健康的重大疾病,筛选天然的生物活性物质用于心血管疾病和癌症的防治研究已经成了食品、药品等领域科学家共同关注的热点问题。因此,金柑果品中生物活性物质的种类和生物活性分析是目前柑橘类果品研究的重要方向,对保健食品,医药领域的发展具有重要作用。我国是金柑属植物的起源中心,拥有所有金柑属植物的生物类型。然而目前关于金柑属植物的生物活性物质的检测种类比较局限,检测方法有待优化,有关金柑果实提物防治代谢紊乱和抗癌功效的研究仍尚未见报道。因此,本研究系统分析了金柑果实醇提物中的化学成分,并探究其防治代谢综合征的功效及作用机制同时初步评价金柑提取物主要成分的抗癌功效。首先,本研究选取了四种我国主要栽培的金柑生物类型,分别是罗纹（Fortunella japonica Swingle,缩写FJ）、大果罗浮（Fortunella margarita Swingle,缩写FM）、兰山金柑（Fortunella crassifolia Swingle,缩写FC1）和浏阳金弹（Fortunella crassifolia Swingle 2,缩写FC2）。采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（Ultra performance liquid chromatography-Q time of flight mass spectrometry,UPLC Q-TOF/MS）分析检测金柑果实提取物中的化学成分,并利用体外抗氧化活性方法评价金柑果实提取物抗氧化活性。其次,评价了FM对高脂膳食诱导的肥胖C57BL/6小鼠代谢紊乱的防治作用。检测FM对小鼠体重,摄食量,葡萄糖耐受量,胰岛素抵抗,血清和肝脏中脂质改善情况,同时利用实时荧光定量PCR技术和报告基因技术对金柑果实提取物调节核受体过氧化物酶增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα）及其靶基因的作用进行了探讨。最后,评价金柑主要生物活性物质的抗癌功效。通过体外微管蛋白聚合实验筛选能影响tubulin聚合或解聚的金柑生物活性物质,然后检测该物质对癌细胞存活率的影响。利用流式细胞技术观察细胞周期,并用激光共聚焦显微镜观察细胞有丝分裂纺锤体形态,以及用免疫荧光蛋白技术检测癌细胞中心体簇积情况。本研究主要试验结果如下:1.金柑果实醇提物化学成分鉴定及抗氧化活性分析1.1金柑果实醇提取物成分鉴定利用UPLC Q-TOF/MS系统鉴定4种金柑果实乙醇提取物的化学成分。使用系统条件:（1）色谱条件。流动相A为0.01%甲酸,B为甲醇;梯度洗脱程序为:0—0.6 min 90%—80%A;0.6—5 min 80%—30%A;5—7 min 30%—10%A;7—8min 10%—90%A;流速:0.4 m L min-1;（2）质谱条件。在正负离子模式下,毛细管电压为0.45 k V;锥孔电压为40 V;离子源温度为100℃;锥孔气流速为50L/h;脱溶剂气温度400℃;去离子气流速600 L/h;低能为6V;高能为20V-40V;扫描范围100 m/z到1000 m/z,数据响应时间为0.2 s。通过与标准品比对信号的保留时间,质荷比及质谱碎片断裂方式等信息初步鉴别出17种化学成分。3′,5′-di-C-glucopyranosylphloretin是金柑果实乙醇提取物中的最主要成分,也是特征性物质。金柑果实醇提取物中的主要化合物为黄酮类化合物。四种不同生物类型的金柑果实中含有的生物活性物质种类基本相同,但是含量差别较大,FM中含有的主要黄酮类物质含量最高。1.2金柑果实醇提取物体外抗氧化活性分析通过DPPH法,FRAP法和ABTS法三种离线法测定4种金柑果实乙醇提取物的抗氧化活性。DPPH和FRAP的结果都表明FM的抗氧化活性最高,其次是FJ,FC的抗氧化活性最低。然而ABTS的结果却显示FC的抗氧化活性最高,其次是FM,FJ的抗氧化活性最低。APC综合评价指数表明FM的抗氧化活性最高。2.金柑果实提取物防治代谢综合征研究2.1预防实验雌性C57BL/6小鼠被分别饲喂对照低脂饲料（Chow）,高脂饲料（HF）,高脂饲料添加1%w/w金柑果实提取物（HF+FME）共计8周。结果发现,FME能预防高脂膳食诱导的小鼠肥胖。FME控制小鼠体重增加,减小肥胖小鼠白脂肪细胞大小。在HF+FME处理组中,FME能够抑制高脂膳食造成的小鼠空腹血糖水平提高,改善葡萄糖耐受紊乱。此外,FME降低血清中总胆固醇水平,低密度脂蛋白水平,以及肝脏总胆固醇水平。2.2治疗实验雌性C57BL/6小鼠先饲喂高脂饲料3个月,诱导成肥胖小鼠。肥胖小鼠随机分配成两组,一组继续饲喂高脂饲料（HF）,一组饲喂高脂饲料添加1%w/w金柑果实提取物（HF+FME）两周。一直饲喂低脂饲料（Chow）小鼠作为对照。结果发现,FME抑制肥胖小鼠体重继续增加,并降低肥胖小鼠空腹血糖,改善肥胖小鼠葡萄糖耐受量和胰岛素抵抗。此外,FME降低肥胖小鼠血清总胆固醇,甘油三酯,血清低密度脂蛋白水平,小鼠肝脏中总胆固醇和甘油三酯水平。2.3分子机理研究通过实时荧光定量PCR对小鼠肝脏中基因表达水平检测,我们发现HF+FME组PPARα的转录水平显著性高于HF组。此外,与HF组相比,HF+FME组PPARα下游靶标如cluster of differentiation 36（CD36）,cytochrome P450 4A10（CYP4A10）,cytochrome P450 4A14（CYP4A14）,acyl-Co A oxidase（ACO）和Stearoyl-Co A desaturase-1（SCD-1）的转录水平同样显著性增加。在HF+FME组中,小鼠褐脂肪Mitochondrial uncoupling proteins（UCP-2）的转录水平显著性高于HF组小鼠。以上结果表明,FME对小鼠糖脂代谢有可能是通过调节PPARα的部分通路来实现的。然而,报告基因结果显示高浓度（200mg/ml）金柑果实提取物,也不能激活PPARα的活性,添加激动剂后,金柑果实提取物对PPARα的活性也无影响。3金柑主要生物活性物质抗癌功效评价3.1微管蛋白体外聚合实验利用微管蛋白体外聚合实验筛选对tubulin蛋白动态聚合有影响的金柑主要生物活性物质。结果发现没食子酸（gallic acid,GA）能促进微管蛋白的解聚,与空白对照相比,GA处理能显著减少微管的长度和数量,对微管成核有抑制作用。3.2 GA抗癌功效研究利用MTT,流式细胞技术,激光共聚焦显微镜,免疫荧光技术等研究了GA对癌细胞存活率,细胞周期,有丝分裂以及中心体簇积的影响。研究结果表明,GA呈时间和浓度依耐性抑制了癌细胞HeLa和Hep G2的细胞存活率。GA影响了HeLa细胞细胞周期,使G2/M期细胞明显增多。激光共聚焦显微镜观察发现GA处理导致HeLa细胞有丝分裂紊乱加剧,纺锤体不规则排列,细胞分裂异常,同时会增加多核细胞比例。免疫荧光实验结果表明GA影响了HeLa细胞多余中心体的正常簇积,这可能是导致细胞纺锤体不正常两极化移动,细胞有丝分裂紊乱,最终导致细胞死亡的原因。综合以上试验结果,我们可以得出以下结论:金柑果实乙醇提取物中主要化合物为黄酮类化合物;在本研究4个金柑生物类型中,FM主要生物活性物质含量最高,抗氧化活性最强;FM能防治高脂膳食诱导的肥胖小鼠代谢综合征;FM果实提取物可能通过参与核受体PPARα信号通路起到调节糖脂代谢作用;金柑主要生物活性物质GA具有一定抗癌功效;GA能引起HeLa细胞有丝分裂紊乱,增加G2/M期细胞比例。