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背景:慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)是西方国家最常见的白血病类型,该疾病目前仍不可治愈。B细胞受体(BCR)信号途径的活化和微环境的因素均在CLL的发生发展中起重要作用。BCR信号是CLL细胞生存和增殖的驱动因素。另一方面,CLL细胞在体内存在凋亡抵抗,然而,与体内不同,CLL细胞在体外则很快发生凋亡,这提示白血病微环境是CLL细胞存活的重要因素。近十年来,微环境在CLL细胞生存和疾病进展中的作用越来越受到重视。CLL的微环境内主要包括基质细胞、T细胞和呵护样细胞(Nurse Like cells,NLCs)。NLCs是单核细胞分化而来的、CLL相关的巨噬细胞。可吸附CLL细胞,从而保护CLL细胞不会出现自发的凋亡。与肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophage,TAM)一样,NLCs表现为M2表型,表达CD14,CD11b,CD68,CD163等。多项研究证实NLCs/巨噬细胞在促进CLL疾病进展中起重要作用。内质网是真核细胞内蛋白质合成、翻译后修饰、脂质合成和钙离子贮存的主要场所。各种外源性或内源性的应激等均可干扰内质网的稳态,诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),并导致未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。ERS与肿瘤细胞的增殖、转移、血管生成、免疫逃逸等密切相关。近来的研究表明,CLL中存在ERS,且ERS在促进CLL的发生发展中起重要作用。抑制ERS相关通路如IRE1-XBP1,GRP78的表达等可抑制白血病的进展。这表明UPR通路是CLL治疗的一个重要靶点。外泌体(exosome)是一种细胞向胞外分泌的、直径大约为30~150 nm的微小囊泡。其中包含有蛋白、m RNA、micro RNA等大量分子学信息并在细胞间通讯发挥重要作用。Exosome可介导肿瘤细胞与肿瘤微环境中免疫细胞间的“对话”并促进免疫逃逸,这也是目前的研究热点。本课题拟研究内质网应激的CLL细胞,是否可以通过释放包含特定内容物的外泌体并作用于巨噬细胞,从而引起巨噬细胞的免疫抑制。目的1.研究内质网应激相关蛋白在CLL中的表达及其临床意义2.评估内质网应激的CLL细胞外泌体对巨噬细胞免疫状态的影响3.阐明内质网应激的CLL细胞外泌体影响巨噬细胞表型变化的机制方法1.收集5例CLL患者外周血,分离原代CLL细胞并提取蛋白,Western Blot检测内质网应激相关蛋白包括GRP78、PERK、ATF6、IRE1、XBP1s的表达。2.收集26例CLL患者骨髓病理标本,免疫组化的方法检测CLL中GRP78的表达,分析GRP78的表达与临床特征的关系。3.采用衣霉素(TM)体外刺激CLL原代细胞和CLL细胞株MEC-1,检测内质网应激相关包括GRP78、PERK、ATF6、IRE1等蛋白的表达。建立CLL的内质网应激模型。4.收集内质网应激的MEC-1细胞上清和未应激的MEC-1细胞上清,提取exosome并鉴定(标记为ERS-exo和CON-exo),Western-Blot法检测外泌体上标志蛋白CD63的表达。透射电镜下观察外泌体形态和大小。BCA定量检测内质网应激对exosome分泌量的影响。5.采用PKH标记外泌体并与巨噬细胞共培养,共聚焦显微镜下观察外泌体是否被巨噬细胞摄取。6.将CON-exo和ERS-exo分别与人原代巨噬细胞和小鼠巨噬细胞Raw246.7共培养24小时,流式细胞术检测巨噬细胞表型变化及PD-L1的表达。CBA方法检测培养上清中细胞因子水平。7.分别将CON-exo和ERS-exo处理后的人原代巨噬细胞上清以及未经处理的巨噬细胞上清,与CLL原代细胞共培养,CCK-8检测比较三组CLL细胞增殖情况。8.建立小鼠异种CLL皮下移植瘤模型,将小鼠分为三组,同时给三组小鼠分别注射单纯MEC-1细胞(空白组)、MEC-1细胞+CON-exo(CON-exo组)、MEC-1细胞+ERS-exo(ERS-exo组),各组注射的MEC-1细胞数量均为5×106个,CON-exo组和ERS-exo组注射的exosome总量为200ug。比较三组小鼠皮下肿瘤大小及肿瘤增殖情况。9.WB法检测CON-exo和ERS-exo这两组外泌体中Hsp72、GP130等蛋白的表达。10.对未经处理的巨噬细胞,CON-exo和ERS-exo处理后的巨噬细胞,提取蛋白,WB法检测STAT3、p-STAT3蛋白表达。q RT-PCR检测巨噬细胞TLR2和TLR4m RNA表达。11.采用STAT3抑制剂SI301-21抑制巨噬细胞上STAT3的表达,WB验证抑制后STAT3和p-STAT3的表达,流式细胞术检测STAT3抑制后巨噬细胞表型变化。12.使用TLR4中和抗体封闭巨噬细胞TLR4后,使用ERS-exo处理巨噬细胞,WB检测巨噬细胞上p-STAT3表达,流式细胞术检测巨噬细胞表型,CBA检测细胞因子的变化。13.干扰外泌体中Hsp72表达后,WB检测巨噬细胞上p-STAT3表达,流式细胞术检测巨噬细胞表型,CBA检测细胞因子的变化。结果1.5例CLL原代细胞中,均检测到GRP78、PERK、ATF6蛋白的表达,仅1例患者中检测到IRE1和XBP1s的表达。2.26例CLL患者中,3例患者阴性表达,8例患者GRP78低表达,15例患者GRP78中-高度表达,GRP78高表达患者与进展期CLL密切相关。3.衣霉素刺激后,CLL原代细胞和MEC-1细胞株后,内质网应激相关蛋白的表达增强。衣霉素可用于建立CLL内质网应激模型。4.透射电镜下观察到提取到的exosome大小在30-100nm,结构为双层、类圆形囊泡样。符合外泌体的特征。WB检测到exosome上有CD63的表达,但未检测到内质网分子伴侣蛋白Calnexin的表达。BCA定量显示内质网应激促进外泌体的释放。5.激光共聚焦显微镜下观察到PKH标记的exosome可被巨噬细胞摄取。6.流式细胞检测结果显示,与无exosome处理的空白组相比,CON-exo组和ERS-exo组均可升高巨噬细胞CD206、CD163,PD-L1的表达,ERS-exo更为明显。而CD80表达则三组间无明显差异。CBA检测细胞因子示CON-exo组和ERS-exo组较空白组的IL-10、IL-6明显升高,ERS-exo组升高更明显。提示ERS-exo可进一步促进巨噬细胞向M2方向极化和PD-L1的表达升高。7.CCK-8检测结果显示,与未经处理的巨噬细胞的上清相比,CON-exo处理后的巨噬细胞上清可促进CLL细胞的生存(P<0.01)。而ERS-exo处理后的巨噬细胞上清较CON-exo处理组更进一步促进CLL细胞的生存。8.小鼠CLL皮下移植瘤模型结果显示,CON-exo和ERS-exo可促进小鼠皮下移植瘤的生长,以ERS-exo最显著。9.WB检测发现ERS-exo较CON-exo富含Hsp72蛋白10.与无exosome处理的巨噬细胞相比,CON-exo处理组和ERS-exo组的巨噬细胞中p-STAT3蛋白表达水平升高。ERS-exo组升高最显著。提示巨噬细胞的极化可能是通过STAT3信号通路活化来调节的。q RT-PCR结果显示,与无exosome处理的空白组和CON-exo组相比,ERS-exo组处理组巨噬细胞TLR4m RNA表达明显升高。11.为进一步验证STAT3信号通路在巨噬细胞的极化中的作用,使用STAT3抑制剂以抑制巨噬细胞中p-STAT3表达,结果发现,加入STAT3抑制剂后,巨噬细胞中CD206和CD163表达明显下降。IL-6和IL-10水平下降。12.使用TLR4中和抗体后,流式细胞术检测发现ERS-exo的处理组巨噬细胞中CD206和CD163表达下调,CBA检测显示IL-6和IL-10水平下降。TLR4中和抗体的使用明显抑制了巨噬细胞STAT3磷酸化。13.构建Hsp72稳定低表达的MEC-1细胞株并提取外泌体,该组外泌体Hsp72表达下降,采用该外泌体处理的巨噬细胞中CD206和CD163表达下调。IL-6和IL-10水平下降。WB检测显示p-STAT3表达下调。结论1.CLL中存在内质网应激网应激相关蛋白的表达。CLL中GRP78的高表达与不良预后特征相关。2.衣霉素可有效建立CLL内质网应激模型。3.内质网应激促进外泌体的释放。4.与CON-exo相比,ERS-exo可诱导巨噬细胞进一步向M2方向极化。5.与CON-exo相比,ERS-exo处理后的巨噬细胞可促进CLL细胞生存。6.ERS-exo通过TLR4/p-STAT3信号通路以促进巨噬细胞向M2方向极化。7.与CON-exo相比,ERS-exo中富含Hsp72。8.内质网应激的CLL细胞可能是通过释放富含Hsp72的外泌体诱导巨噬细胞进一步向M2方向极化的原因。