真核生物细胞中蛋白质降解参与新陈代谢、细胞分裂周期进程、对淋巴细胞的抗原提呈和许多其它重要功能的调节。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)负责细胞中许多调控蛋白的降解。26S蛋白酶体是一2.5 MDa的巨大蛋白质复合物，由一个具有蛋白质降解活性的20S蛋白酶体(core particle，CP)和两个结合在20S蛋白酶体两个末端的19S调节颗粒(regulatory particles，RP)组成。除了已确定的蛋白酶体亚基外，近年来许多与蛋白酶体相关的、起着辅助作用的分子被鉴定。许多蛋白酶体研究是用酵母细胞来实现的，尤其是芽殖酵母。到目前为止，绝大部分酵母蛋白酶体亚基对应的哺乳动物蛋白酶体亚基已经被鉴定出来。为进一步确定哺乳动物蛋白酶体的组份和相关调节蛋白质，邱小波教授等人改良了基于亲和纯化的方法来快速从哺乳动物细胞中纯化26S蛋白酶体。用此方法，他们发现了一个新的45 kDa(407个氨基酸残基)的19S调节复合物的亚基命名为hRpn13(以前研究中将之称为ADRM1或GP110)。hRpn13能通过N-端部分(Δ201-407)与26S蛋白酶体结合，通过C-端部分(Δ1-200)与去泛素化酶UCH37结合。以前的研究报道表明hRpn13／ADRM1／GP110是一个高度糖基化的膜蛋白(110 kDa)并参与调节细胞粘附。Rpn13是hRpn13在芽殖酵母中的同源物，它与爪蟾胚胎发育所必须的Xoom(404个氨基酸的蛋白质)在N-端高度同源，而Xoom在爪蟾胚胎发育过程中发挥重要作用。本研究是在邱小波教授等研究的基础之上进行的。经生物信息学分析表明hRpn13在真核细胞中高度保守，与酵母蛋白酶体亚基Daq1／Rpn13是同源基因，在细胞中可能有多种相互作用蛋白，并且可能发挥多种不同的功能。ADRM1／hRpn13在小鼠不同组织中的表达谱实验表明，ADRM1／hRpn13在所检测的小鼠各组织中均能表达，并且在睾丸、脑、胰腺、脾等组织中呈相对较高的表达。脑、胰腺、肝、肌肉和心脏等组织中存在一些迁移缓慢的ADRM1／hRpn13，推测其可能存在翻译后修饰。前期实验表明，hRpn13与蛋白酶体相关的蛋白质UCH37(ubiquitin carboxy-terminalhydrolase 37，去泛素化酶／异肽酶)相互作用。为更进一步确定两者的相互作用关系，我们构建了相关表达载体，用原核系统表达并纯化了His-hRpn13、His-hRpn13-C(Δ1-200)、GST-UCH37、GST-UCH37-N(A227-329)、GST-UCH37-C(Δ1-226)和His-S5a等蛋白质。GST pull down实验表明，当纯化的His-hRpn13与GST-UCH37、GST-UCH37-N(Δ227-329)和GST-UCH37-C(Δ1-226)一同孵育时，UCH37的全长和不保守的C-端延伸部分(Δ1-226)能与hRpn13共沉淀，而GST-UCH37-N(Δ227-329)则不能，表明UCH37通过C端与hRpn13结合，并且是与hRpn13的C-端部分(Δ1-200)结合。同样，我们将纯化的GST-UCH37与His-S5a共同孵育，结果发现UCH37能与S5a在体外结合，而作为对照的GST蛋白则不能与S5a结合。因此，在蛋白酶体中hRpn13和S5a均能与UCH37结合，它们可能是通过互补的机制将UCH37募集到蛋白酶体的。文献报道UCH37是26S蛋白酶体中19S复合物中的一个去泛素化酶／异肽酶。明确了hRpn13与UCH37的相互作用后，我们进一步研究了hRpn13对UCH37去泛素化酶活性的影响。作为阳性对照，当昆虫细胞中纯化的His-hRpn13与UCH37共同孵育时，发现UCH37水解Ub-amc荧光底物的活性增加。采用原核表达纯化的全长hRpn13与UCH37共同孵育时，我们发现UCH37水解Ub-amc荧光底物的活性增加了69％。在相同条件下，原核表达纯化的hRpn13的C-端部分(Δ1-200)对UCH37的活性却无明显影响。另外，邱小波教授等人发现hRpn13的C-端部分(Δ1-200)能引起细胞死亡。为了阐述该现象的机制，我们测试了hRpn13的C-端部分(Δ1-200，该部分不与蛋白酶体结合)能否与全长的hRpn13结合。GST pull down实验结果表明，与UCH37不同，全长hRpn13不能在体外与hRpn13的C-端部分(Δ1-200)结合。因此，hRpn13的C-端部分(Δ1-200)引起细胞死亡，可能是通过阻止UCH37而不是hRpn13结合到蛋白酶体上的机制。综上所述，在哺乳动物26S蛋白酶体中，hRpn13将UCH37募集到蛋白酶体的19S复合物中，它通过N-端与蛋白酶体结合，通过C-端与UCH37结合，在UCH37和蛋白酶体之间起到非常重要的桥梁作用，并且hRpn13能增强UCH37的去泛素化酶的活性。YWK-Ⅱ蛋白是一种Ⅰ型精子膜蛋白，最初是由本组采用一株抗人精子蛋白的单克隆抗体(YWK-Ⅱ)对大鼠睾丸λgt11 cDNA文库进行筛选获得的，定位于人精子头部的赤道区。序列分析发现YWK-Ⅱ蛋白与Alzheimer’s病(老年性痴呆)相关的A4蛋白前体(APP)存在广泛的同源性和区域保守性，胞内区和跨膜区有70.6％的同源性。其后自人胎盘中筛选的该蛋白被命名为淀粉样蛋白前体同源蛋白(APPH)，并发现与大鼠淀粉样蛋白前体样蛋白2(APLP2)非常相似，为同一蛋白在不同种属中的不同形式。体外研究发现，重组表达的YWK-Ⅱ蛋白／APLP2胞内段能够被PKC和cdc2激酶磷酸化，并可以和GTP结合蛋白G_o蛋白相互作用，表明YWK-Ⅱ蛋白／APLP2可能是一种与G_o蛋白耦联的受体。采用酵母双杂交系统，发现YWK-Ⅱ蛋白／APLP2与穆勒氏管抑制性物质(Mullerianinhibiting substance，MIS)存在相互作用。YWK-Ⅱ蛋白／APLP2与MIS的相互作用已经GST Pull-down实验和表面等离子共振实验(SPR)在体外进行了验证。文献报道，MIS在成熟精子上存在结合位点，但没有证据显示，该结合位点即MIS的Ⅱ型受体，也没有证据显示，精子中有已知的MIS的Ⅱ型受体的表达。MIS的功能是多方面的，已发现其可在体外促进人精子的存活力和活动力，但与其相关的受体和信号通路仍不清楚。根据以上数据，我们推测MIS可能首先与YWK-Ⅱ蛋白／APLP2相互作用，通过G_o蛋白介导信号传导通路，引起人精子的存活力和活动力。本研究的前期工作中，采用细胞膜表达YWK-Ⅱ蛋白／APLP2细胞模型，我们发现YWK-Ⅱ蛋白／APLP2通过与MIS和G_o蛋白相互作用，作为介导MIS引起细胞存活的受体。然而，MIS对精子这种影响的机制仍不清楚，因为精子中可能不存在MIS的Ⅱ型受体。因此，我们提出假设，YWK-Ⅱ蛋白／APLP2可能是G_o耦联的介导MIS引起精子细胞存活作用的受体。本研究在此基础上，分析了以下几个问题：1)证明了CHO细胞、COS-7细胞及人精子中均无MISR的Ⅱ型受体(MISRⅡ)的表达，提示COS-7细胞与CHO细胞一样可用于研究YWK-Ⅱ蛋白／APLP2作为MIS受体的细胞模型；人精子可用于今后的动物体内实验。2)MIS可引起过表达YWK-Ⅱ蛋白／APLP2的COS-7细胞中ERK1／2信号通路的激活，与CHO细胞模型的结果一致，表明YWK-Ⅱ蛋白／APLP2作为受体介导MIS引起的ERK1／2活化具有一定的普遍性。3)经MIS处理的过表达YWK-Ⅱ蛋白／APLP2的CHO细胞，p53表达水平下降，pro-caspase-3表达增强；YWK-Ⅱ抗体则可减弱后者的表达。提示YWK-Ⅱ蛋白／APLP2作为受体介导MIS增强细胞存活可能是通过抗凋亡机制。此外，应用组织芯片技术验证了YWK-Ⅱ蛋白／APLP2在胰腺癌组织中较正常胰腺组织中的表达增强，提示YWK-Ⅱ蛋白／APLP2可能参与胰腺癌的发生发展过程，为发掘YWK-Ⅱ蛋白／APLP2在肿瘤免疫治疗中的应用价值奠定基础。