研究背景:胰高血糖素样肽（GLP-1）是肠上皮L细胞分泌的一种肽类激素,它的主要功能是以葡萄糖依赖的方式促进胰岛素的合成与分泌,并且具有减重的功能。因此,临床上采用多种GLP-1受体激动剂（GLP-1RAs）治疗糖尿病及肥胖等代谢紊乱性疾病。目前针对GLP-1在调节糖代谢机制方面的研究已经非常清楚了,但是关于脂代谢调节作用机制方面的研究相对较为缺乏。Irisin是2012年发现的一种肽类激素,来源于其前体蛋白Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5（FNDC5）,可从骨骼肌、脂肪和胰腺等多种组织中释放。Irisin由运动诱导产生,主要参与白色脂肪组织（WAT）向棕色脂肪组织（BAT）的转化,进而增加机体能量消耗。同时,irisin也被报道可作为炎症和各种代谢紊乱性疾病的标志物。因此,iirsin作为治疗代谢疾病的新的潜在的药物靶点而受到科学家的广泛关注,但其在表达、裂解、循环水平和检测等方面仍存在很大的分歧。虽然尚无证据表明GLP-1和irisin这两个重要信号分子之间存在任何直接联系,一些间接证据却暗示这两种分子在脂代谢等功能调节方面可能存在某种内在联系。研究目的:1.探讨GLP-1与FNDC5的上下游调节关系;2.鉴定GLP-1激活fndc5基因表达的关键调控元件及因子,阐明GLP-1调控fndc5基因的具体分子机理;3.证明fndc5是GLP-1调节脂质代谢的关键基因之一。4.确认分泌型FNDC5亚型的存在,明确此亚型的生物学功能。研究方法:1.RNA提取及qRT-PCR检测细胞及小鼠组织中相关基因的表达。2.Western blot检测细胞及小鼠组织中各种蛋白的表达情况。3.FNDC5启动子-荧光素酶融合基因的构建。4.采用CRISPR-Cas9技术敲除βLox5细胞中FNDC5的表达。5.采用ELISA检测法,检测细胞培养上清中irisin的分泌水平。6.重组sFNDC5蛋白的表达与纯化。7.观察重组sFNDC5对高脂喂养的肥胖小鼠各种基础指标、皮下及内脏脂肪组织、糖耐量、血清中脂质代谢指标以及肝脂肪沉积的影响。8.统计学分析:本研究所有试验至少进行3次生物学重复,每次生物学重复包含2组技术重复。多组间统计学差异采用Prism 7软件进行分析,结果采用单因素方差分析或Student’s t检验。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。研究结果:1.GLP-1调控FNDC5在胰岛β细胞中的表达（1）GLP-1在基因和蛋白水平上均可上调人（βLox5）或大鼠（INS1）胰岛β细胞中FNDC5的表达。（2）GLP-1可提高βLox5细胞培养基中irisin的分泌水平。（3）PKA,AKT和ERK信号通路均参与GLP-1诱导的胰岛β细胞中FNDC5的表达。（4）GLP-1受体激动剂“利拉鲁肽”可上调小鼠脑及胰腺组织中FNDC5的表达。2.GLP-1调控FNDC5表达的分子机理（1）通过Genomatix Suite Collection在线工具,在不同哺乳动物的fndc5基因启动子所在序列中均能预测到一个保守的CREB转录因子结合位点。（2）通过将构建的fndc5启动子-萤光素酶质粒和不同浓度的CREB表达质粒共同转染HEK293细胞,转染24小时后检测到荧光信号随CREB表达质粒浓度的增加而增强。（3）为进一步缩小GLP-1特异性激活fndc5表达的启动子调控区域,使用亚克隆技术构建不含CREB结合位点的fndc5启动子-萤光素酶基因结构,与CREB表达质粒共同转染HEK293细胞。转染24小时后,在细胞中检测到的荧光信号与对照组相比无显著差异。3.FNDC5参与介导GLP-1诱导的βLox5细胞中脂解及自噬功能（1）构建FNDC5敲除βLox5细胞系。（2）通过Western blot检测,FNDC5敲除βLox5细胞中FNDC5蛋白不表达;通过ELISA检测法,GLP-1也不上调FNDC5敲除βLox5细胞分泌irisin的水平。（3）评估GLP-1在野生型和FNDC5基因敲除细胞中的脂解及自噬功能。GLP-1在野生型βLox5细胞中诱导的脂解及自噬相关基因和蛋白的表达在FNDC5敲除细胞中被抑制。4.分泌型FNDC5的发现（1）通过在fndc5基因C末端设计引物进行PCR反应,在INS-1细胞的PCR产物中检测到了长短不等的两条条带。（2）对两条带进行测序,结果显示分子量较大的条带即为目前报道的FNDC5蛋白编码基因序列的一部分（即膜结合型FNDC5,mFNDC5）,分子量较小的条带则为一条不含FNDC5跨膜区序列的片段（即分泌型FNDC5,sFNDC5）。（3）通过qRT-PCR检测,在大鼠的各个组织器官中均能检测到两种FNDC5亚型的存在。5.制备重组sFNDC5蛋白（1）使用毕赤酵母表达系统表达和纯化出高浓度的重组sFNDC5蛋白。（2）考马斯亮兰染色显示重组sFNDC5蛋白有五个条带,分子量在18-27 kDa之间。（3）经PNGase F去糖基化酶处理后,变为单一的一条分子量在18 kDa左右的条带。6.重组sFNDC5蛋白可诱导FNDC5敲除βLox5细胞脂解基因的表达重组sFNDC5蛋白刺激野生型和FNDC5敲除βLox5细胞,脂解相关基因的表达均增高。7.重组sFNDC5蛋白可以促进分化成熟的3T3-L1细胞棕色化及增强脂代谢（1）qRT-PCR及Western blot结果显示,经sFNDC5蛋白处理的分化成熟的3T3-L1细胞,棕色化和脂代谢相关基因及蛋白的表达水平明显增高。（2）Western blot结果显示,sFNDC5蛋白对脂肪细胞的功能是通过ERK和AKT信号通路的磷酸化实现的。8.重组sFNDC5蛋白对高脂饲养的肥胖小鼠具有脂代谢调节功能（1）给高脂喂养的肥胖小鼠腹腔注射重组sFNDC5和irisin蛋白,14天后小鼠附睾重量及体重均明显降低。（2）sFNDC5和irisin注射小鼠,葡萄糖耐量（GTT）及胰岛素耐量（ITT）得到明显改善。（3）sFNDC5和irisin注射小鼠,血清中甘油三酯、胆固醇以及游离脂肪酸的含量均不同程度地降低。（4）sFNDC5和irisin注射小鼠,皮下及内脏脂肪组织中UCP-1的表达明显升高。（5）sFNDC5和irisin注射小鼠,肝脏脂肪积累减少,脂肪酸β-氧化基因表达增加。结论:本研究生论文以培养细胞和小鼠为研究对象,采用较全面的分子生物学研究方法,探讨了 GLP-1与Irisin前体蛋白Ⅲ型纤连蛋白组件包含型蛋白5（FNDC5）的上下游调节关系。研究发现,GLP-1可诱导胰腺β细胞中FNDC5的表达,并且是通过其下游转录调控因子CREB与fndc5启动子中的结合元件相互作用实现的。此外,GLP-1在β细胞中介导的脂质代谢调节作用是通过诱导FNDC5的表达实现的。此外,我们发现大鼠INS-1细胞及大鼠的各种组织器官中存在一种可分泌的FNDC5亚型（sFNDC5）,后者对胰腺β细胞、脂肪细胞和饮食诱导的肥胖小鼠模型均具有脂代谢的调节作用。