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米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase,ROL）为1,3位置专一性脂肪酶,具有良好的水解和酯化活性,广泛应用于食品加工、生物柴油制备及手性化合物拆分等工业领域,但其天然产量极低,难以满足工业需求。利用基因工程技术提高ROL的表达量,对促进其工业化应用有着重要意义。毕赤酵母具有遗传操作方便、能执行蛋白翻译后修饰和易于高密度发酵等优点,已被成功用于多种蛋白的高效异源表达。通常采取增加基因拷贝数和共表达分子伴侣的策略来提高毕赤酵母中重组蛋白的表达水平,但由于毕赤酵母可用筛选标记有限,使用现有的分子生物学方法进行多次基因操作相对困难,在一定程度上限制了多种基因工程策略的协同应用。为此,本文一方面探究并改进了多种毕赤酵母基因操作方法,另一方面采用合适的改进方法,结合选择强启动子、筛选最佳基因剂量以及联合共表达多途径辅助因子等策略,最终获得了多株ROL高产重组菌,并通过3-L高密度发酵实现了ROL的高水平表达,为重组ROL的规模化生产及工业化应用奠定了理论及方法学基础。主要研究内容和结果摘要如下:1.探究影响ROL在毕赤酵母中高效表达的关键因子,表明基因剂量的影响最大。初步考察了米根霉脂肪酶前序列、载体整合位点、启动子和基因剂量对重组ROL在毕赤酵母中表达的影响,结果发现前序列和基因剂量对ROL表达的影响较大。为此,以含前序列的ROL（proROL）为出发基因,通过增加基因剂量,筛选到一株酶活力高达1200 U/mL的重组菌株GS115/9K-Zα-Hα-proROL 3#。对该菌株在摇瓶和3-L高密度发酵的条件进行了优化,最终获得的最高脂肪酶活力达11,500 U/mL。2.探索了转化后介导载体扩增法（posttransformational vector amplification,PTVA）实现毕赤酵母基因拷贝数增加的机制,发现PTVA并不总是导致整个外源载体的拷贝数增加。成功构建了抗生素基因两端不含任何相同DNA片段的重组菌GS115/Zeocin和抗生素基因两端含pAOX1、AOX1-TT和5’AOX等多对重复DNA片段的重组菌GS115/Zα-ROL-5’AOX。研究发现重组菌GS115/Zeocin不适宜进行PTVA筛选,而重组菌GS115/Zα-ROL-5’AOX抗生素基因两端重复的pAOX1、AOX1-TT和5’AOX片段均能介导PTVA中抗生素基因的复制扩增。3.通过多拷贝载体优化基因拷贝数,提高ROL在毕赤酵母中的表达水平。首先构建了ROL基因单拷贝表达载体pAOα-ROL,并通过优化的“生物砖”法构建了含2至8拷贝ROL基因重组载体,以此构建了含1至8拷贝ROL基因的重组菌株GS115/pAOα-nROL（n=1,2,3…8）。摇瓶发酵结果表明,含5拷贝ROL基因的重组菌GS115/pAOα-5ROL 11#产酶活力最高,达2700 U/mL,较单拷贝重组菌提高了近8倍;以山梨醇/甲醇混合补料,该重组菌3-L高密度发酵115 h后最高酶活力达20,500U/mL。4.共表达辅助蛋白,进一步增强ROL在重组菌中的表达。在GS115/pAOα-5ROL11#重组菌中分别共表达了12种不同的辅助蛋白,发现Ssa4、Bmh2、Sso2、Ubc1、Hrd1、Pdi、Bip、Hac1和VHb等9种辅助蛋白均能促进ROL的表达。其中,来源于内质网相关蛋白降解（endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD）途径的Ubc1或Hrd1及参与蛋白分泌途径的Ssa4、Bmh2或Sso2等辅助蛋白使ROL的表达量提高达30-45%。分别将ERAD和分泌途径相关的不同辅助蛋白与ROL进行联合共表达,结果筛选到产酶性能最佳的克隆子GS115/5ROL-Hrd1-Ubc1 1#和GS115/5ROL-Ssa4-Sso2-Bmh2 4#,其酶活力分别达4750 U/mL和5230 U/mL。然后,以GS115/5ROL-Ssa4-Sso2-Bmh2 4#为出发菌,进一步分别共表达其它也能促进ROL表达的辅助蛋白,结果仅VHb与Ssa4、Bmh2和Sso2表现出协同促进作用,筛选到1株重组菌GS115/5ROL-Ssa4-Sso2-Bmh2-VHb 9#,摇瓶发酵酶活力达5650 U/mL,为起始菌GS115/pAOα-5ROL 11#的1.8倍,3-L高密度发酵126 h后ROL最高酶活力达41,700 U/mL。5.改进毕赤酵母基因敲除方法,敲除Gas1基因改变细胞壁通透性,提高ROL表达。改进了Pop-in/Pop-out法,使得反筛选过程中能同时利用正向筛选标记对目的基因缺陷型重组菌进行富集。与双交换法相比,运用改进的Pop-in/Pop-out法分别使Och1基因和Gas1基因的敲除成功率由0和20%提高到79%和近100%。使用改进的方法敲除了GS115/pAOα-5ROL 11#重组菌中Gas1基因,结果其酶活力由3080 U/mL增加到3900 U/mL,进一步联合共表达辅助蛋白Ssa4、Bmh2和Sso2,获得的重组菌的ROL酶活力提高至4630 U/mL。6.建立毕赤酵母基因连续无抗性整合方法,为重组ROL未来应用于食品、药品等领域奠定了方法学基础。基于改进的Pop-in/Pop-out法设计了一种基因无抗性整合方法,并以此分别尝试了lox71片段和ROL基因的无抗性整合,结果随机各挑选的3个重组菌中Zeocin抗生素基因等多余的DNA片段均被成功剔除。此外,基于Cre/loxP位点特异性重组系统,创建了一种基因连续无抗性整合的方法。通过交替使用66-R66型载体pZHCreAOX66-R66（ROL）和R71-71型载体pZHCreAOXR71-71（ROL）,成功实现了ROL基因的三轮无抗性整合。在每轮整合后筛选到的去除抗性的重组菌中,Cre基因、抗生素基因及冗余的His4基因等多余DNA片段以目的重组方式被剔除的阳性克隆子占40-67%。