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研究背景:恶性肿瘤已经成为全球性健康与卫生问题。结直肠癌是全球诊断率排名第三的消化道恶性肿瘤,尽管近年来诸多针对结直肠癌的早诊早筛方法与综合治疗方式,使结直肠癌相关的死亡率有所下降,但是对于中晚期的结直肠癌、甚至已发生结直肠癌远处脏器转移患者的治疗效果仍较为有限。因此,发现新的生物标志物与有效的治疗靶点,对于晚期靶器官转移结直肠癌患者更有针对性的治疗成为了近年来的研究热点。肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）作为恶性肿瘤基质细胞中主要成分之一,参与构成肿瘤微环境,可调控恶性肿瘤的生物学行为,以及诱导正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）向CAFs分化等。但CAFs与癌细胞之间的信号传递、物质交换等相互作用机制目前尚未明确。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类内源性非编码RNA,通过其对mRNA的降解和翻译抑制在转录后水平起到调控基因表达的作用。MiRNA-181家族与多种肿瘤的增殖、分化、转移等密切相关,家族成员之一miR-181a在众多肿瘤性疾病的发生、转移过程中,以及在辅助诊断、判断预后等方面起到关键作用。外泌体（exosomes）,也被称为小胞外囊泡s EVs（small extracellular vesicles）,与微囊泡及凋亡小体等亚群共同构成细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）。因其具有双层脂膜结构,包裹有核酸、蛋白质、脂质等生物活性分子,在癌症发生、发展等过程中起着重要作用。研究发现外泌体包裹的miRNA（exosomal miRNA）在各种疾病的进展中的重要性尤为突出。诸多研究显示,外泌体可携带mRNA、DNA、miRNA等进入到靶细胞发挥调节作用,并且可作为生物标志物用于疾病的诊断,也可作为治疗的靶标,或作为运载工具将特定物质递送至靶细胞发挥调控作用。转化生长因子（transforming growth factor-beta,TGF-β）超家族成员调控多种细胞功能,包括细胞的增殖、粘附、迁移,以及参与实质脏器的纤维化过程等,并且通过与基质细胞相互作用影响着恶性肿瘤的发生、发展。SMAD家族蛋白（Sma-and Mad-related protein）作为被TGF-β受体调控的、下游胞内信号转导的重要激酶底物之一,在肾脏、肝脏等重要实质脏器的纤维化发生、进展过程中起到重要作用。本研究主要关注结肠癌相关成纤维细胞CAFs外泌体递送的miRNA-181a如何通过TGF-β/Smad途径调控受体肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移能力,以及与肿瘤细胞的“上皮-间充质”转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）之间的关联。研究目的:研究CAFs分泌的外泌体携带miRNA-181a经TGF-β/Smad途径对结肠癌细胞增殖、侵袭等表型的调控作用,并且探寻CAF-exosomal miRNA-181a及其靶基因Smad7通过TGF-β/Smad以及上皮-间质转化过程调控结肠癌细胞增殖、侵袭可能的作用机制。研究方法:本研究共分为以下部分:第一部分,复苏本实验室保存的CAFs并进行体外培养及鉴定。超速离心法分离CAFs条件培养基中的外泌体、并进行理化性质的表征。应用共聚焦显微镜观察CAFs外泌体被结肠癌细胞的摄取情况,并检测人结肠腺癌细胞系HCT116、HT-29、Lo Vo、Ca Co-2、SW-480中miR-181a的表达。第二部分,调控CAF-miR-181a并分别与HCT116和HT-29细胞系进行共培养后应用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力,划痕实验、Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力。流式细胞术检测凋亡情况,q PCR和Western blot、免疫荧光、ELISA法检测了TGF-β/Smad信号通路相关分子,以及上皮标志物E-钙粘附蛋白,间质标志物Vimentin,N-钙粘附蛋白的表达。第三部分,通过生物信息学方法预测了miRNA-181a下游靶基因Smad7,q PCR法验证miR-181a与Smad7之间的靶向调控关系,通过回复实验在调控miR-181a的基础上,分别上调或下调Smad7观察对结肠癌细胞的增殖、侵袭的影响,及TGF-β1,Smad7,E-钙黏蛋白和波形蛋白的表达。体内实验中明确调控CAFs中miR-181a后对裸鼠移植瘤增殖的影响。研究结果:1、本实验第一部分,成功复苏并培养CAFs,并对其进行鉴定;超速离心法成功分离出CAFs条件培养基来源的外泌体,并成功对其理化性质进行表征;共聚焦显微镜观察结肠癌细胞成功摄取了CAFs的外泌体。通过在HT29,SW-480,Lo Vo,HCT116,Caco2五种结肠腺癌细胞系中验证miR-181a的表达,筛选了相对低表达miR-181a的HT-29,和高表达miR-181a的HCT116为后续研究对象。2、第二部分,实验证实CAFs与CAFs外泌体相比,外泌体中具有更高的miR-181a水平;调控CAFs-miR-181a分别与HCT116和HT-29细胞系进行共培养后,发现抑制CAFs的miR-181a可增强结肠癌细胞的增殖、划痕愈合能力,促进Transwell的侵袭与迁移能力,流式细胞术检测其凋亡比例降低,上调CAFs的miR-181a趋势相反;q PCR、WB、免疫荧光、Elisa检测抑制CAFs的miR-181a后TGF-β/Smad通路分子和间质标志物波形蛋白、N-钙黏附素表达升高,上皮标志物E-钙黏附素表达降低,同样在上调CAFs的miR-181a后各分子表达趋势相反。3、第三部分,通过生物信息学方法预测miR-181a下游靶基因Smad7,通过q PCR证实miR-181a与Smad7之间存在负向调控关系,通过回复实验在调控miR-181a的基础上分别上调或下调Smad7,结果显示过表达Smad7可促进结肠癌增殖、侵袭能力以及上调TGF-β1、Smad7和波形蛋白的表达,下调E-钙黏蛋白的表达;而下调Smad7后各分子的表达趋势相反。体内实验中明确下调CAFs的miR-181a后促进裸鼠移植瘤的增殖。研究结论:本研究通过体外和体内实验,明确了:（1）CAFs分泌高丰度的外泌体,含有高浓度的miR-181a,并且可被结肠癌细胞摄取;（2）通过调控CAFs的miR-181a可影响结肠癌的增殖、侵袭能力,通过TGF-β/Smad通路调控结肠癌细胞上皮-间质转化过程;（3）通过研究调控CAFs的miR-181a与下游靶分子Smad7之间的相互作用,明确过表达Smad7可促进结肠癌的恶性生物学行为,可能为CAFs-miRNA的临床应用提供理论和实践依据。