牙齿相关干细胞及组织工程技术为采用新的生物性修复方法提供了可能。本课题组率先提出生物性牙根再生的新概念，并已在体外及小型动物体内获得重要进展。本研究利用与人类牙颌系统相对相似的小型猪进行根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞复合生物支架进行生物牙根再生，并探讨牙周膜干细胞修复实验性牙周炎骨缺损的能力，旨在为利用牙齿相关干细胞结合组织工程技术进行生物性牙齿再生修复及牙周再生修复提供大型动物的实验依据。本研究包括以下三部分。 第一部分小型猪根尖牙乳头及牙周膜干细胞体外分离培养及生物学特性研究 目的：分离培养小型猪根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞，研究其生物学特性，为利用干细胞进行生物牙根再生及牙周修复治疗打下基础。方法：选取3只成年小型猪，无菌条件下拔除尖牙，剥离牙根外牙周组织，切取根尖牙乳头组织，参照以往关于人牙齿相关干细胞的培养方法及条件分离培养小型猪根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞，并通过倒置显微镜、流式细胞仪、透射电镜、扫描电镜等对其生长特性、诱导分化能力及在三维支架材料羟基磷灰石/β-磷酸三钙(HA/TCP)上的生长情况进行观察。结果：原代培养的小型猪根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞生长良好，呈多角形或梭性，牙周膜干细胞比根尖牙乳头细胞稍大。根尖牙乳头干细胞克隆形成率为(20～130个/105)，牙周膜干细胞的克隆形成率为(1～23个/105)。流式细胞仪结果显示，分离培养的根尖牙乳头干细胞中有7.6％抗Stro-1抗体表达阳性，牙周膜干细胞中5.6％表达阳性。第2代根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞的倍增时间最快，且根尖牙乳头干细胞生长速度快于牙周膜干细胞。透射电镜下可见，第1～3代根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞生长良好，胞浆内线粒体、高尔基体和粗面内质网丰富，随着培养时间的延长，分泌的细胞外基质增多。扫描电镜观察结果表明，根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞在HA/TCP三维支架上生长良好，充分伸展，并分泌大量细胞外基质。经诱导分化后，根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞在体外有诱导分化成脂肪的能力。结论：小型猪根尖牙乳头干细胞及牙周膜干细胞均可被成功的分离培养，在体外表现出良好的生长状态，并有横向分化的潜能，有望为牙齿再生和牙周组织工程研究提供有用的细胞来源。 第二部分根尖牙乳头及牙周膜干细胞介导再生生物牙根小型猪体内实验研究目的：利用根尖牙乳头及牙周膜干细胞复合生物支架在小型猪体内再生生物牙根。方法：选取5只成年小型猪，分离培养小型猪根尖牙乳头和牙周膜干细胞，将1×108培养至第3代的根尖牙乳头和牙周膜干细胞与牙根形三维支架材料HA/TCP复合，分别回植于小型猪上、下颌骨内，共回植生物牙根8个。观察3～9月，定期摄X线片和CT，观察回植物在体内的生长情况。在回植后9个月进行组织学观察。结果：在回植初期，在牙根材料表面可见到不规则的吸收影像，回植牙根轮廓尚清晰，周围牙槽骨的密度降低。回植3月时，牙根密度增加，与周围牙槽骨间有类似牙周膜影像的低密度透光区。在回植第9个月时，回植材料仍为类似牙根的形状，但尺寸比最初植入时减小。组织像显示再生的牙根组织有类似牙本质、牙骨质样结构，并有类似Sharps纤维的结构插入正在形成的类似牙本质或牙骨质样结构。结论：利用根尖牙乳头及牙周膜干细胞复合HA/TCP在小型猪体内能形成类似牙根形态的结构。 第三部分牙周膜干细胞介导修复实验性牙周炎骨缺损的小型猪体内研究目的：利用牙周膜干细胞在小型猪体内修复实验性牙周炎骨缺损。方法：采用4种骨缺损加结扎丝线的方法建立小型猪实验性牙周炎模型，探讨可靠的建模方法。用分离培养的第3代牙周膜干细胞与HA/TCP混合后回植于小型猪实验性牙周炎骨缺损部位。用临床指标(菌斑指数、龈沟出血指数、牙周探诊深度、临床附着丧失)、影像学及组织病理学结果评价牙周组织修复效果。结果：本研究所采用的骨缺损加结扎丝线的方法可形成稳定的小型猪实验性牙周炎模型。用牙周膜干细胞联合HA/TCP治疗小型猪实验性牙周炎骨缺损3月后，牙周探诊深度为3mm，与实验前无显著性差异(P＞0.05)，与空白对照组和HA/TCP组有显著性差异(P＜0.05)；大体观察没有明显的骨缺损；组织学显示回植处有大量新骨形成，牙周组织再生良好。结论：小型猪牙周膜干细胞复合HA/TCP有良好修复再生牙周骨缺损效果。