目的心肌缺血再灌注损伤是临床实践中常见的组织器官损伤,其准确机制仍不十分清楚。研究结果表明心肌缺血再灌注损伤是一种急性炎症反应,缺血再灌注时心肌组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)产生增加是导致心脏功能障碍和心肌细胞坏死的重要原因之一,抑制TNF-α的产生能减轻心肌细胞损伤、有助于缺血心肌功能的恢复。近年来,中药防治心肌缺血再灌注损伤的研究取得了一定进展。血必净注射液是从36组中药处方中筛选而来,具有抗细菌毒素、降低内毒素水平、调节免疫及炎性介质、改善微循环、保护血管内皮细胞的作用。本研究应用Langendorff离体心脏工作模型,排除了神经体液及外周血管阻力等因素对药物作用的影响,观察血必净注射液对心肌缺血再灌注损伤是否具有保护作用,并探讨其保护作用的可能机制。材料与方法选择健康Wister大鼠30只,体重250±50g,雌雄不限,按随机化原则分成对照组与血必净组,每组15只。实验大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,腹腔注射肝素钠500U抗凝。开胸并迅速取出心脏,立即浸入4℃K-H液中,经主动脉插管以后连接于自制langendorff离体心脏灌注装置上,以37℃K-H液逆行灌注,灌注压恒定为70mmHg。经15min的自然灌流平衡后,对照组及血必净组分别用ThomasⅡ停搏液及含有血必净注射液(4ml/kg)的ThomasⅡ停搏液进行停搏。两组心脏经常温(37℃)缺血30min后以37℃K-H液再灌注至复跳后120min。试验结束后留取部分左心室心肌立即放入10℃甲醛中,固定12-20小时后制成腊块标本;另取部分左心室心肌于-70℃冰箱冰冻保存。分别计量缺血前、缺血再灌注30min、缺血再灌注60min、缺血再灌注90min、缺血再灌注120min的冠脉流出液流量(CF),并留取各时点流出液3ml,用全自动生化检测仪检测其肌酸激酶(CK)含量;于光学显微镜下观察心肌形态学变化;采用酶联免疫方法(ELISA)测定心肌再灌注120minTNF-α浓度。采用SPSSl3.0统计软件进行数据处理,计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,组间比较采用重复测量数据的方差分析,两两比较用多重比较t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、CF的变化:与对照组相比,血必净组缺血再灌注以后各时间点的CF值明显升高(P＜0.05)。2、冠脉流出液中CK的变化:与对照组相比,血必净组缺血再灌注以后各时间点的CK值明显降低(P＜0.05)。3、心肌形态学变化:对照组心肌细胞心内膜水肿,部分区域心肌血管扩张充血,心肌炎症细胞浸润;血必净组心肌细胞形态基本正常,水肿较轻。4、心肌组织TNF-α的浓度变化:与对照组相比,血必净组缺血再灌注以后的TNF-α值明显降低(P＜0.05)。讨论TNF-α是心肌缺血再灌注早期心肌细胞产生的炎性细胞因子,是一种自分泌的作用因子,在缺血再灌注损伤、脓毒症、慢性心功能不全、病毒性心肌炎以及心脏同种移植排斥反应中均能导致心肌功能能障碍和心肌细胞坏死。心肌组织进行再灌注循环时,巨噬细胞和心肌细胞本身受刺激分泌产生TNF-α,然后通过两种途径作用于血液中的白细胞,导致炎症及损伤的发生:(1)直接作用方式,一般在再灌注后10分钟即出现白细胞的趋化移动、积聚、并释放化学物质,导致再损伤发生。(2)TNF-α先作用于原发损伤部位的内皮细胞,激活其表面无活性的白细胞趋化粘附因子,这种被激活的趋化粘附因子诱导白细胞向原发损伤部位移动并粘附于损伤的组织细胞上,从而使白细胞释放一系列化学物质导致组织的再损伤。该过程一般较缓慢,在再灌注后4小时组织的再损伤达到高峰。动物实验发现,在心肌缺血再灌注1小时和4小时除血浆TNF-α显著增高外,代表中性粒细胞浸润指标的髓过氧化物酶在缺血心肌中也明显增高。光镜下也可见大量中性粒细胞在心肌中的浸润,TNF-α的释放与中性粒细胞在心肌中的聚集密切相关,氧自由基损伤指标脂质过氧化物丙二醛含量在缺血心肌中也显著升高。这些结果提示,心肌缺血再灌注时TNF-α增高同时伴有中性粒细胞浸润和心肌损伤加重。因此,TNF-α是心肌缺血再灌注损伤过程中的一个非常重要的环节,抑制它的生成可能对于心肌缺血再灌注损伤的保护起到决定作用。血必净注射液的有效成分红花黄色素A、川芎嗪、丹参素、阿魏酸、芍药苷、原儿茶醛主要从红花、赤芍、川芎、丹参、当归等中草药中提炼而来。研究表明血必净注射液能有效拮抗内毒素,下调促炎介质水平,调节免疫反应,并可以保护受损内皮、改善微循环,避免内毒素攻击所致的组织损伤。也有实验证实血必净注射液治疗可以明显抑制肝、肺组织TNF-α蛋白水平上升幅度,并且能使其快速恢复至正常范围。且其含有的多种中药成分被证实对于微血管损伤、中性粒细胞释放、细胞凋亡等均有抑制作用。本试验成功制作了大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,并在血必净组中加入血必净注射液。实验结果表示与对照组相比:血必净组缺血再灌注以后各时点CF值明显增高、CK值明显降低;光镜下炎症反应及水肿程度明显下降;心肌组织中TNF-α的含量明显降低。结合心肌缺血再灌注损伤机制以及TNF-α对其影响来看,血必净注射液可能通过减少氧自由基产生、保护心肌细胞膜、降低脂质过氧化、减轻钙超载、减轻炎症反应、减少内毒素攻击并能抑制心肌TNF-α的生成,从而对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。结论1、血必净注射液可以增加缺血再灌注心肌的CF,抑制心肌CK的释放,具有减轻心肌细胞损伤、保护心肌细胞膜的作用。2、血必净注射液可以明显改善缺血再灌注心肌的超微结构,对缺血再灌注的心肌细胞具有保护作用。3、血必净注射液可以显著减少心肌组织TNF-α的生成,并可能通过抑制TNF-α的生成来实现其心肌保护作用。