荧光定量PCR技术因具有快速、准确、灵敏度和重复性高,可减少污染等特点而广泛应用于分子生物学和医学研究领域,可以对很多种病原微生物进行定量检测。本研究的目的是建立起特异性强、灵敏度高、重复性好的HBV、HCV和HIV-1实时定量血清(或血浆)病毒检测方法。另外本实验还建立了一种能同时检测、鉴定和定量三种病毒的多重实时定量RT PCR检测方法。定量PCR有多种类型。本实验对Taqman PCR进行了研究并与LUX方法进行了比较,结果表明LUX方法不支持一步法RT-PCR并且重复性差,因而不适合病毒的检测。而Taqman PCR有很好的特异性、灵敏度和重复性,因而更适于对HBV、HCV和HIV-1的核酸进行定量。血清(或血浆)DNA(或RNA)的提取是实时PCR检测的重要一环,因为它直接影响病毒载量测定的准确性。本实验我们建立了一种基于磁珠的快速、高效血清病毒核酸提取方法。核酸在高浓度离液盐的情况下与磁珠结合,在微碱性条件下被洗脱。该方法DNA的回收率为80%以上,而RNA的回收率在70%以上。将这种方法的灵敏度与Qiagen公司的病毒DNA和RNA提取试剂盒进行比较,结果表明它们有很好的相关性。这些特点决定了这种提取方法适用于传染病的诊断和病毒载量的测定。本实验使用这种基于磁珠的快速、高效的病毒核酸提取方法,建立了特异性强、灵敏度高、重复性好的HBV、HCV和HIV-1实时PCR检测体系,可用于血清病毒载量的测定。通过分别检测系列10倍稀释的HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA(10-106拷贝/反应)来评价三种检测体系,结果表明,每一种检测体系的Ct值与DNA或RNA的Log10值之间都能形成很好的线性关系。三种检测体系具有很高的灵敏度,最低可达50拷贝/ml。HBV、HCV和HIV-1的检测体系为监测治疗效果、研究病毒载量与疾病的不同阶段的关系提供了理想的工具。本实验还建立了能同时检测和定量HBV、HCV和HIV-1三种病毒的多重实时定量RT-PCR检测方法。在这种三联的检测中,荧光染料我们分别选择了FAM, HEX和Cy5,并且挑选出HBV, HCV和HIV-1最佳的引物探针组合。结果显示一种病毒核酸的扩增不会对其它两种产生影响。通过在一管中同时检测系列10倍稀释的HBVDNA、HCV RNA和HIV-1 RNA(10-106拷贝/反应)来评价三种检测体系,结果表明,多重检测体系的Ct值与DNA或RNA的Log10值之间都能形成很好的线性关系。该检测体系具有很高的灵敏度,最低可达50拷贝/ml。与单重的检测相比也显示出很好的相关性。这表明这种检测体系有大规模用于献血筛查的潜力。HBV实时PCR检测体系被用来研究血清病毒DNA和血清标志物之间的关系。取HBsAg和HBV DNA均为阳性的样本检测HBeAg.抗-HBc,抗-HBs和抗-HBe。在121份HBsAg和HBV DNA均为阳性的样本中总结出了10种血清HBV M的模式。含高拷贝HBV DNA的样本多数都是HBeAg阳性的模式,但有些HBeAg阴性的样本也含有高水平的HBV DNA。本实验还通过AFP的检测,确定了18例原发性肝癌(AFP>400 ng/ml)。所有这些样本均为HBeAg阴性,其中12份样品的DNA水平还比较低。综上所述,HBV M的检测与HBV DNA的检测结合起来具有十分重要的意义,这样才能够更准确地反应HBV感染和复制的状况。