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第一部分AR促进RCC细胞增殖和侵袭迁移的功能研究目的检测雄激素受体(AR)在肾癌(RCC)中的表达,构建干扰和过表达AR的RCC细胞系,通过检测干扰或过表达AR的RCC细胞系增殖和迁移侵袭能力的差异,探讨AR对RCC细胞增殖和迁移侵袭的功能影响。方法Western blot检测OSRC-2、HK、ACHN和SW-839细胞中AR的表达情况。并以AR阳性前列腺癌(PCa)细胞系C4-2和AR阴性PCa细胞系PC-3作为AR对照,GAPDH作为内参。构建稳定低表达AR (sh-AR)的SW-839的细胞系及稳定高表达AR(OE AR)的OSRC-2、ACHN细胞系。Western blot检测sh-AR SW-839细胞中AR的表达情况以及OEAR的OSRC-2、ACHN细胞系中AR的表达情况,以验证所构建细胞系是否成功。采用Transwell Assay检测sh-AR的SW-839细胞和OE AR的OSRC、ACHN细胞迁移和侵袭的能力。并两两比较组问RCC细胞侵袭能力差异：①sh-AR的SW-839细胞组对比scr对照组；②OE AR的OSRC-2、ACHN细胞组对比空载质粒对照组(Vec),并做统计学分析组间差异。利用3D spheroid侵袭试验进一步证实Transwell侵袭实验的结果：①sh-AR的SW-839细胞组对比scr对照组;② OEAR的OSRC-2细胞组对比Vec对照组,并做统计学分析组问差异。最后采用MTT增殖实验在细胞增殖能力差异的角度论证调控AR表达对RCC进展的影响：① sh-AR的SW-839细胞组对比scr对照组；② OE AR的OSRC-2、ACHN细胞组对比Vec对照组,并做统计学分析组间差异。结果我们首先检测了AR在各种RCC细胞系中的表达情况,发现AR在SW-839细胞系中高表达,而在OSRC-2、ACHN细胞系中低表达。然后我们通过调节AR的表达水平研究AR在RCC进展中所扮演的角色。采用Transwell Assay检测细胞迁移和侵袭的能力,我们发现与各自相应的对照组相比,干扰SW-839细胞AR的表达可以抑制细胞侵袭。而过表达AR的OSRC-2、ACHN细胞获得更强的侵袭能力。通过3D spheroid侵袭实验我们得到了与Transwell Assay类似的结果,与各自相应的对照组相比,干扰SW-839细胞AR的表达可以抑制细胞侵袭。而过表达AR的OSRC-2、ACHN细胞获得了更强的侵袭能力。我们还用MTT法检测AR表达程度对各个细胞系增殖能力的影响,与各自相应的对照组相比,干扰AR的表达使得SW-839增殖能力明显下降,而过表达AR的OSRC-2、ACHN细胞增殖能明显上升。经统计学分析,所有组问差异P<0.05。结论首先,sh-AR SW-839的细胞系及OE AR的OSRC-2、ACHN细胞系构建成功。AR在普通OSRC-2、ACHN细胞中低表达,在普通SW-839细胞中高表达。AR可以促进RCC细胞的增殖和迁移侵袭。以上结论为下一步探讨AR促进RCC增殖和侵袭迁移能力的机制奠定了基础。第二部分MiR-145受AR负性调节抑制肾癌细胞的增殖和侵袭迁移的功能研究目的研究miR-145在RCC中的表达水平以及与AR表达的相关性。研究miR-145对RCC增殖和侵袭迁移的影响。方法采用Real-time PCR来检测AR对下游一系列miRNA差异性表达的影响。PCR检测分析验证AR对miR-145的影响。应用Real-time PCR对RCC临床标本的癌组织及癌旁组织中AR和miR-145的表达情况进行检测并做相关性分析。通过Transwell assay和MTT assay检测同时调控AR和miR-145的表达对RCC细胞增殖和迁移侵袭的影响。结果我们采用Real-time PCR发现人为调控AR的表达水平后,在一系列的miRNA差异变化中miR-145差异性表达最显著。同时采用PCR分别在SW-839和OSRC-2、ACHN细胞中验证了干扰AR后miR-145差异性高表达(P<0.01);过表达AR后miR-145差异性低表达(P<0.01)。最后我们检测20例RCC患者,癌组织与癌旁组织中AR及miR-145的表达情况,发现在肿瘤组织中AR高表达而在癌旁组织中miR-145高表达,相关性分析提示AR和miR-145表达呈负相关(r=-0.453,p=0.045,n=20)。通过Transwell assay和MTT assay我们发现过表达miR-145或过表达AR可以分别抑制或促进RCC细胞的侵袭和增殖。反之,抑制miR-145或抑制AR后可以分别促进或抑制RCC细胞的侵袭和增殖。结论我们通过实验,多角度论证了在RCC细胞中AR可以抑制miR-145的表达。AR的表达与miR-145的表达成呈负相关。miR-145受AR的负性调节抑制RCC的增殖和侵袭迁移。第三部分AR-miR-145-HIF2a轴在肾癌中分子机制研究目的研究AR抑制miR-145的作用机制以及AR抑制的miR-145通路影响RCC进展的作用机制。方法通过染色质免疫共沉淀实验检测AR是否结合到miR-145的启动子区域。采用western blot检测AR是否通过p53抑制miR-145的表达。建立稳定低表达AR(sh-AR)和稳定高表达AR (OE-AR)的RCC细胞系,通过western blot检测低表达AR及高表达AR时,HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表达变化来研究AR与HIF2a、VEGF、MMP9和CCND1的影响关系。通过western blot检测转染了miR-145 mimic后,HIF2a、VEGF、MMP9和CCND1的表达变化,来了解它们之间的影响关系。通过western blot检测sh-AR的SW-839细胞及OEAR的OSRC-2细胞中分别转染miR-145 inhibitor及miR-145 mimic前后HIF2α、 VEGF、MMP9和CCND1表达变化来了解在VHL突变型RCC细胞系中AR抑制miR-145发挥促癌作用的机制。在VHL野生型ACHN细胞中的类似研究,探讨AR-VHL通路与AR-miR-145通路的关系。结果AR反应元件(ARE)位于miR-145转录起始区上游575个碱基处。通过染色质免疫共沉淀实验发现AR通过与miR-145启动子区域的ARE结合从而抑制miR-145的表达。提示AR能在转录层面调控miR-145的表达。通过western blot实验我们观察到sh-AR所诱导miR-145的表达增加程度可以被抑制p53表达(p53-shRNA)减弱,说明p53在AR的上游调控miR-145的表达。AR可以通过与miR-145启动子区域的ARE直接结合来抑制p53对miR-145转录的激活。通过western blot发现AR可以增加HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表达;而miR-145能降低HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1的表达,另外通过转染miR-145 mimic或miR-145 inhibitor可以一定程度上逆转AR对HIF2α、VEGF、MMP9和CCND1表达的影响,说明在VHL突变型SW-839及OSRC-2细胞中AR抑制miR-145发挥促癌作用是通过激活HIF2a/VEGF/MMP9/CCND 1信号通路来的实现的。在VHL野生型ACHN细胞中,miR-145抑制VHL表达；转染miR-145 mimic可以逆转AR对VHL表达的促进作用及AR对VHL下游通路的激活作用。无论是在VHL突变型还是VHL野生型RCC细胞中,AR抑制miR-145通路在RCC进展中都扮演重要角色,其作用是通过激活HIF2a/VEGF/MMP9/CCND 1信号通路来实现的。结论AR通过调控p53来抑制miR-145启动子活性。AR通过miR-145调节HIF2a的表达。无论是在VHL野生型还是VHL突变型RCC细胞中,AR-miR-145-HIF2a轴对于RCC的进展都起着至关重要的作用。第四部分AR通过抑制miR-145促进肾癌生长和转移的体内实验研究目的通过体内实验证实了AR通过抑制miR-145促进RCC进展,这种作用是通过诱导HIF2a表达上调来实现的。方法首先构建了高表达AR(OEAR)及高表达miR-145(OE miR-145)的OSRC-2细胞细胞系。通过PCR检测构建好的细胞系中miR-145的表达情况。将分组好的OSRC-2细胞原位异种移植到裸鼠肾包膜下,使用IVIS成像系统(体外成像)监测肿瘤进展对比肿瘤的大小。处死小鼠,取出肾脏及肿瘤。按照分组对比肿瘤的质量,统计学方法检验有无差异。观察RCC在膈肌及肝门的转移情况,比较各组间RCC转移发生的情况及转移灶的多寡。HE染色确认转移灶是否为RCC细胞。免疫组化确认AR/HIF2a/VEGF/MMP9/CCND1在不同组别的表达情况是否与第三部分采用western blot检测所得结果相同。结果构建并验证稳定高表达miR-145的OSRC-2细胞系。PCR验证效果,两组之间比较miR-145的表达水平有显著差异(P<0.01),说明细胞系构建成功。5周以后观察结果。与对照组Vec-AR相比,过表达AR的OSRC-2细胞导致裸鼠体内肿瘤生长速度和肿瘤质量明显增加；而稳定表达miR-145的OE-AR OSRC-2细胞可以部分逆转AR促癌作用,并减少RCC肿瘤生长速度和肿瘤重量。通过IVIS图像系统发现,OE-AR组的6只裸鼠中5只发生转移；对照组有2只发现转移灶。而在OE-AR+OE-miR-145组只有1只老鼠发生转移;OE-miR-145组没有老鼠发现转移灶。HE染色证实了裸鼠肾脏以及转移灶的肿瘤都是RCC细胞。免疫组化确认AR/HIF2α/VEGF/MMP9/CCND1在不同组别的表达情况与第三部分采用western blot检测所得结果相同。结论通过体内实验证实了AR通过抑制miR-145激活下游HIF2α/VEGF/ MMP9/CCND1等因子而促进RCC生长和转移的机制。