Wnt信号通路是一类高度保守的信号通路,它在胚胎发育过程、组织的形成及维持、细胞的更新及命运决定、色素的沉积等生命活动过程发挥着重要的调控作用。Wnt信号通路是由Wnt基因编码的一大类蛋白分泌到细胞外,并与下游细胞膜上的受体结合,从而引起细胞内级联反应,进而调控靶基因的表达。家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫。家蚕Wnt信号通路的研究有助于我们了解Wnt信号通路在家蚕胚胎发育、中肠以及脂肪体的发育过程当中所起的重要生理作用。Wnt1是Wnt家族的一员,其是wingless基因与小鼠的int1基因合并而来。已有研究表明,Wnt1基因的敲除会导致家蚕胚胎个体发育异常、体节扭曲、色素沉积缺陷,最终在胚胎期死亡。然而,目前关于Wnt1基因对家蚕幼虫个体的生长发育的研究还是一片空白。Wnt1基因是否参与调控家蚕幼虫个体的生长发育?如果参与,Wnt1基因如何调控家蚕幼虫个体的生长发育?针对以上的科学问题,本文通过在家蚕中过表达Wnt1基因,发现Wnt1基因确实调控了家蚕幼虫个体的生长发育,得到的主要研究结果如下:1.Bm Wnt1及下游效应基因Bmpangolin基因的胚胎时期表达谱我们通过对家蚕胚胎时期进行取材,并反转合成c DNA。q PCR结果表明,随着胚胎时期的发育,Bm Wnt1基因的表达呈逐渐下调的趋势,表明Bm Wnt1基因主要在胚胎发育的前期发挥作用。q PCR分析Bmpangolin的表达趋势,发现其表达趋势与Bm Wnt1一致,随胚胎的发育进程呈现逐渐下调的趋势,暗示Bmpangolin可能是Bm Wnt1的下游效应因子。2.Bm Wnt1靶基因Bmpangolin、Dpp鉴定Bmpangolin是位于细胞核内发挥作用的转录调控因子。因此,我们进行了Bmpangolin亚细胞定位实验。实验结果表明Bmpangolin定位于细胞核,与预期一致。为了进一步证明Bmpangolin响应Wnt1信号通路,我们构建了Bm Wnt1细胞过表达载体,并在Bm E细胞上过表达Bm Wnt1基因,48 h后收取细胞,提取c DNA。q PCR分析显示,与对照相比,Bm Wnt1基因在细胞中成功过表达,并且Bmpangolin基因的表达量也显著上调。然而,在过表达Bm Wnt1基因的细胞中,Dpp的表达受到了明显抑制。为了进一步验证Bm Wnt1基因对Bmpangolin和Dpp基因的调控效应,我们进行了双荧光素酶活性实验。首先构建Dpp启动子不同截短长度-1500、-1205、-1112、-1054、-996的p GL3载体,并与1180-Bmpangolin过表达载体共转染细胞。结果显示,相较于对照,全长-1500启动子酶活显著降低,并且随着预测结合位点的逐个删除,酶活性逐渐增加。以上结果表明,Bmpangolin、Dpp基因是Bm Wnt1基因下游的效应因子。3、Bm Wnt1过表达家蚕的构建及表型分析构建Bm Wnt1个体过表达载体,进行胚胎注射。荧光筛选获得Bm Wnt1过表达阳性个体。相较于对照,过表达Bm Wnt1个体生长缓慢,体型较小;表皮背部体节出现异常斑纹;每一龄期生长过程都会有个体死亡,四、五龄期尤其明显,个体存活时间最长只能到上簇时。解剖过表达个体,发现过表达Bm Wnt1家蚕个体中肠发育异常,肠壁变薄且易破碎;脂肪体发育异常,相较于对照明显减少。4、Bm Wnt1过表达家蚕中肠发育受到抑制相较于对照个体,Bm Wnt1过表达品系中肠较小,肠壁松弛易破损。提取中肠RNA进行c DNA合成,然后进行荧光定量检测。结果发现中肠发育相关基因表达明显下调。为了进一步验证这一结果,我们进行Bm Wnt1基因的干涉实验,发现经双链RNA干涉后,Bm Wnt1的表达被成功下调,而中肠发育相关基因的表达量显著上调,表明Bm Wnt1基因能够抑制中肠发育相关基因的表达。5、Bm Wnt1过表达家蚕脂肪体脂质合成受阻显微镜下观察Bm Wnt1过表达家蚕个体脂肪体,相较于对照组,过表达家蚕个体脂肪体明显变薄,脂质合成明显减少。进一步对脂肪体进行Nile Red染色,发现过表达Bm Wnt1家蚕个体脂滴含量明显减少。q PCR分析显示,在过表达Bm Wnt1家蚕脂肪体中,脂质合成相关基因显著下调,脂质代谢相关基因明显上调。