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第一部分 感觉神经参与调控骨髓间充质干细胞分化平衡[目的]探究感觉神经在骨髓间充质干细胞分化过程中能否对其成骨成脂平衡发挥调控作用,感觉神经缺失时候观察成骨、成脂分化平衡是否会发生变化。[方法]我们利用Cre-loxP系统构建3月龄雄性条件性基因敲除小鼠Advilin-TrkA-/-,先天性敲除感觉神经上的TrkA受体,抑制感觉神经生长。通过μCT和OsO4骨髓腔脂肪染色扫描分析、Perilipin,Osteocalcin免疫荧光染色、骨髓间充质干细胞体外三系分化实验包括结晶紫染色、茜素红染色和油红O染色、流式细胞术分析和分选成骨前体细胞和成脂前体细胞的占比和体外三系分化实验。分析敲除感觉神经的小鼠体内的骨髓间充质干细胞分化趋势变化。[结果]3月雄性感觉神经敲除Advilin-TrkA-/-小鼠股骨骨量BV/TV平均为10.42%,相比于野生型TrkA-/-组的17.23%的骨量下降了 6.81%（P<0.05）,OsO4骨髓腔脂肪染色脂肪细胞沉积的数量和密度Advilin-TrkA-/-比TrkA-/-组增加明显（P<0.05）,免疫荧光染色显示Osteocalcin阳性成骨细胞在Advilin TrkA-/-中对比野生型明显减少,Perilipin阳性的脂肪细胞显著增多（P<0.05）。骨髓间充质干细胞体外三系分化培养结果Advilin TrkA-/-比TrkA-/-组结晶紫染色CFU-F、茜素红染色CFU-OB显著减少,油红O染色CFU-AD明显增加（P<0.05）。流式细胞术分析和分选成骨前体细胞和干细胞群感觉神经敲除Advilin TrkA-/-比TrkA-/-组明显减少（P<0.05）,分选后体外成骨分化能力减弱,而成脂前体细胞增加,分选后体外成脂分化能力增强。[结论]在条件性敲除和诱导性敲除小鼠感觉神经的模型中,小鼠股骨骨量显著降低,伴随着的是骨髓腔中脂肪细胞的堆积。股骨切片染色观察到感觉神经缺失的情况下成骨细胞显著减少,同时出现更多脂肪细胞;流式细胞术也印证了这一现象,同时干细胞增殖能力减弱。说明先天性感觉神经缺失的小鼠可导致骨量丢失和骨髓成脂分化增加,而这一现象很有可能说明了感觉神经与骨髓间充质干细胞分化功能和分化方向有密切联系。第二部分 骨感觉神经通过接受成骨细胞来源前列腺素E2信号维持骨髓间充质干细胞分化平衡及调控机制[目的]探究前列腺素E2是否可以通过感觉神经对骨髓间充质干细胞分化其调控作用,并探究前列腺素E2的来源,阐明感觉神经调控骨髓间充质干细胞的可能机制。[方法]构建条件性敲除感觉神经EP4受体小鼠Avil-EP4-/-以及敲除成骨细胞源的前列腺素E2上游合成酶COX2小鼠OCN-COX2-/-,对其及对照组进行骨μCT,OsO4染色检测骨量和骨髓腔脂肪沉积情况。Perilipin,Osteocalcin免疫荧光染色、干细胞体外三系分化实验、流式细胞术分析和分选成骨前体细胞和成脂前体细胞的占比分析转基因鼠及对照组小鼠体内的骨髓间充质干细胞分化趋势变化。向上述转基因鼠及对照组内注射前列腺素E2降解酶抑制剂SW033291阻断剂四周并通过μCT,免疫荧光染色等方法观察小鼠骨量和间充质干细胞分化的变化。[结果]3月股骨骨量BV/TV显示Avil-EP4-/-的9.4%相较于野生型组17.3%明显降低（P<0.05）,OCN-COX2-/-相比于野生型骨量同样降低（P<0.05）,OsO4染色骨髓腔脂肪含量均增加明显（P<0.05）。Osteocalcin染色在Avil EP4-/-组和OCN-COX2-/-组明显减少,perilipin染色相较于野生型增多（P<0.05）,流式细胞分析和流式分选和体外三系分化结果均显示Avil-EP4-/-组和OCN-COX2-/-组的成骨前体细胞变少（P<0.05）,间充质干细胞成骨分化能力降低;成脂前体细胞数量增加,成脂分化能力提高,干细胞数量下降。SW033291能够增加野生型小鼠的骨量,成骨细胞,减少野生型小鼠髓腔脂肪细胞沉积,抑制成脂分化。但不能增加Avil-EP4-/-组和OCN-COX2-/-组的骨量和成骨细胞数量。成骨分化和干细胞分化的功能仍然受感觉神经EP4功能缺失的抑制。[结论]通过对Avil-EP4-/-和OCN-COX2-/-的小鼠进行研究,说明成骨细胞来源的前列腺素E2通过感觉神经的EP4受体参与正向调控骨量,骨髓间充质干细胞的分化。当感觉神经EP4受体功能受到损害,或是成骨细胞COX2分泌不足时,骨髓间充质干细胞的分化和增殖功能将受到显著影响。这阐明了外周感觉神经调控骨髓间充质干细胞分化的具体作用机制。第三部分 前列腺素E2通过感觉-交感神经环路调控LepR+骨髓间充质干细胞分化及其在骨折愈合中的作用[目的]探究骨髓中能够响应感觉-交感神经环路调控间充质干细胞的亚群,验证受调控的干细胞分化后成骨细胞、成脂细胞的来源,分析此环路在骨折愈合中的作用。[方法]构建LepR-cre;YFP转基因小鼠,其特点表现在但凡表达过LepR的细胞其本身及分化的后代均能染上黄色荧光,我们在此小鼠上注射Capsaicin辣椒素构建去除感觉神经模型,通过μCT和OsO4染色观察其骨量和骨髓腔内脂肪沉积的改变。给与SW033291和交感神经抑制剂后利用免疫荧光染色观察股骨远端CGRP+的感觉神经以及Osteocalcin成骨细胞和perilipin脂肪细胞的改变,通过对GFP和perilipin的共染进行干细胞命运示踪的检测。我们在注射Capsaicin的LepR-cre;YFP的小鼠基础上构建股骨中段骨折模型,同时在此基础之上再给Capsaicin组和对照组注射SW033291,通过μCT,Masson、SOFG化学染色及免疫荧光Osteocalcin 和 perilipin观察骨量,骨折愈合及局部干细胞分化对其的影响。[结果]注射Capsaicin组的LepR-cre;YFP小鼠的骨量明显低于对照组,骨髓腔脂肪沉积较对照组多。Capsaicin组的CGRP+感觉神经纤维和Osteocalcin成骨细胞明显减少,Perlipin脂肪细胞增加,GFP和Perilipin共染的脂肪细胞较对照组增多,SW033291并不能逆转Capsaicin导致增多的共染脂肪细胞,在Avil-EP4-/-组和OCN-COX2-/-组应用肾上腺素β2受体阻断剂后其下降的骨量恢复,其丢失成骨细胞增加,而增多的perilipin有所减少。μCT及SOFG和Masson化学染色观察到Capsaicin组的股骨骨折断端骨折愈合情况显著差于对照组,骨折断端Capsaicin组脂肪细胞增加明显,成骨细胞减少,单位视野的YFP+的脂肪细胞在Capsaicin组增加显著。SW033291在野生型小鼠中能够显著刺激骨折断端愈合,不能够改善Avil-EP4-/-的骨折延迟愈合的表型。[结论]骨髓腔内主要受到感觉神经-交感神经轴调控的干细胞为LepR+间充质细胞,局部释放的前列腺素E2能够通过感觉神经的Ep4受体而影响交感神经兴奋性,主要影响骨髓腔内LepR+间充质干细胞的分化,进而影响骨折愈合。