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炎症反应是机体抵抗病原入侵，消灭病原体的正常自我保护机制，然而过度的炎症反应会导致机体损伤，导致相关免疫性疾病的发生，对炎症反应的精确调控显得尤为重要。微小RNA(miRNA)是一段长为19～24nt的非编码小RNA分子，在进化过程中高度保守。miRNA通过与靶基因mRNA3UTR完全或部分结合，对靶mRNA剪切降解或抑制其翻译，miRNA介导的转录后水平在炎症反应和免疫调节中发挥重要作用。 mmu-miR-322与人miR-424同源，是miR-322家族的重要成员，miR-322在多种疾病情况下差异表达，且在不同组织细胞中具有高度的保守性。研究表明，miR-322在细胞增殖、细胞分化等生物学过程中发挥重要作用，但miR-322在免疫调节中的作用及生物学功能尚待进一步研究。因此，本研究通过分析炎症反应与miR-322的关系;研究miR-322在巨噬细胞增殖分化中的作用;预测miR-322靶基因并揭示其相互作用，阐明miR-322在炎性反应中的调控作用，为揭示其免疫调控功能奠定基础。 具体研究方法如下: qPCR检测miR-322的表达变化:LPS刺激RAW264.7细胞，qPCR检测miR-322的表达，结果显示，LPS刺激后miR-322表达下调，且具有时间依赖性，提示miR-322可能参与了炎症反应的调控。 miR-322对炎症反应的影响:将miR-322 mimics转染RAW264.7细胞，转染24h后LPS刺激，qPCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，结果显示，LPS刺激后IL-1β、IL-6、TNF-α大量表达，而在转染miR-322后IL-1β、IL-6、TNF-α的表达被显著抑制。由此表明，miR-322负调控LPS诱导的炎症反应。 miR-322对LPS介导的巨噬细胞增殖的影响:将miR-322 mimics转染RAW264.7细胞，转染24h后LPS刺激，qPCR检测细胞周期蛋白cyclinD、cyclinE、P21、P27的表达，结果显示，LPS刺激后cyclinD、cyclinE显著下调，P21、P27显著上调，说明LPS刺激导致细胞周期紊乱，抑制了细胞增殖，而在转染miR-322后，LPS诱导的cyclinD、cyclinE下调以及P21、P27上调被明显抑制，表明miR-322能够影响细胞周期进程，随后利用流式细胞技术进一步验证发现miR-322能够促进巨噬细胞周期进程，进而促进细胞增殖，缓解细胞损伤。利用MTT法检测活细胞数，同样证明了该结果，即LPS刺激后，活细胞数显著减少，细胞损伤严重，而在转染miR-322后细胞损伤得到缓解，活细胞数明显增加。以上结果共同表明，miR-322能够促进巨噬细胞增殖，缓解炎性损伤。 靶基因的预测:利用miRNA靶基因预测软件(miRanda、 targetscan)预测miR-322靶基因，发现miR-322能够与NF-κB1互补结合，提示NF-κ B1可能是miR-322的靶基因。 miR-322靶基因的验证:将NF-κB13UTR克隆至双荧光素酶质粒上，构建双荧光素酶报告载体以及突变体，将其与miR-322 mimics(模拟物)以及miR-322 inhibitors（抑制剂）共转染至293T细胞，检测荧光素酶活性，结果显示，miR-322转染组荧光素酶活性明显下调，且差异显著(P＜0.0001)，miR-322 inhibitors组荧光素酶活性显著上调，差异显著(P＜0.05)，表明miR-322能够与NF-κ B1相互作用。随后利用qPCR以及western blot技术检测miR-322对NF-κ B1 mRNA及蛋白水平表达的影响，结果显示转染miR-322 mimics后NF-κB1 mRNA及蛋白水平均明显下调，转染miR-322 inhibitors后结果相反。表明NF-κB1是miR-322的靶基因，并且通过miR-322通过降解NF-κ B1 mRNA来实现对NF-κ B1的表达抑制。 结论:miR-322通过靶向抑制NF-κ B1表达负调控LPS介导的炎症反应，并且miR-322能促进细胞增殖，缓解炎性损伤。