小麦(Triticum aestivum L.)是世界上分布最广、种植面积最大的粮食作物之一。随着人口增多和自然环境的不断恶化、水资源短缺以及土壤盐碱化程度的日趋严重,小麦的需求量与供应量之间的矛盾也愈来愈突出,培育抗逆小麦品种及增加小麦产量已成为当务之急。传统的小麦育种主要利用品种间杂交来培育新品种,采用远缘杂交和诱变育种等方法创造新种质。经过长期努力,小麦的产量逐渐提高,品质不断得到改进。然而近年来,由于可利用的种质资源限制,大大制约了常规育种工作的成效。远缘杂交虽然创造了大量的育种材料,但这些材料一般存在着某些缺点,需要经过多代选择才能直接用于小麦育种。基因工程技术的发展和应用,打破了物种间基因流动的限制,能将外源基因导入小麦细胞并获得转基因植株,为小麦育种开辟了新途径。利用生物技术提高小麦耐盐抗旱性具有重要的战略意义。由于小麦遗传转化难度大,基因组庞大,且实验周期长,尽管小麦抗逆基因工程研究倍受重视,但发展速度仍落后于水稻、玉米、棉花等农作物,利用基因工程方法培育小麦抗旱耐盐品种是小麦生物技术研究的一个重要课题。本论文以发展本实验室已初步建立的小麦茎尖遗传转化技术体系为起点,通过向小麦优良品种中引入甘氨酸甜菜碱合成途径的酶基因(来自大肠杆菌的编码胆碱脱氢酶基因betA、来自耐盐藻青菌的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶基因ApGSMT2和肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶基因ApDMT2),开展提高小麦抗旱耐盐性的研究。一、转基因小麦的产生和转基因表达分析以小麦优良品种济南17、济麦19和济麦22为受体,采用农杆菌介导的茎尖遗传转化法分别将betA、ApGSMT2和ApDMT2导入小麦细胞中,通过除草剂抗性(选择标记基因为bar或epsp,它们编码的酶分别抗除草剂草丁膦和草甘膦)筛选和分子检测(PCR、Southern杂交),筛选出来自济南17的15个转betA基因的株系、来自济麦19的27个转ApGSMT2和ApDMT2基因的株系、来自济麦22的27个转ApGSMT2和ApDMT2基因的株系。在适宜条件下,遗传转化频率在3.67%—5.35%之间。转基因植株的Southern杂交结果表明,外源基因已经整合到小麦基因组中并在后代中稳定遗传,外源基因的拷贝数为1-2个。RT-PCR结果表明外源基因在小麦中能够活跃表达,但表达强度在不同株系中有明显差异。取3个转betA基因纯合的株系BL1、BL2和BL3的T2代植株以及野生型(济南17)植株进行盐胁迫下转基因表达分析。Real-time RT-PCR结果表明,在野生型植株中没有检测到betA基因转录本；在盐胁迫处理前,尽管转基因由组成型强启动子Ubiquitin启动,betA基因的表达丰度只有小麦(?)ctin表达丰度的1%左右；200 mMNaCl处理12天,3个转基因株系的betA基因表达量分别增加了6.3倍、8.8倍和10.3倍。甘氨酸甜菜碱含量测定结果表明,盐胁迫处理前,转基因株系BL1、BL2和BL3的叶片甘氨酸甜菜碱含量为116.5-134.9μmol g-1 DW,显著高于野生型的(106.0μmol g-1 DW); 200 mM NaCl处理12天,转基因株系BL1、BL2和BL3植株的甘氨酸甜菜碱水平分别升高到179.7、281.2和363.0μmol g-1 DW,分别是野生型(157.4μmol g-1 DW)的1.1、1.8和2.3倍。推测在盐胁迫条件下betA基因的转录本半衰期增长,以致细胞合成更多的甘氨酸甜菜碱。选取转betA基因纯合的株系BL6、BL7和BL9的T3代以及济南17(野生型对照)的植株进行干旱条件下的转基因表达分析。未经干旱处理前,BL6、BL7和BL9的betA基因表达丰度是小麦actin的1%左右,干旱胁迫处理7天,3个转基因株系的betA基因表达量分别增加了4.3倍、8.3倍和5.2倍。叶片甘氨酸甜菜碱含量测定结果显示,干旱处理前,3个转基因株系的含量为82.6-97.1μmolg-1DW,显著高于野生型的(72.1μmol g-1 DW);干旱处理7天,转基因株系的甘氨酸甜菜碱含量分别上升到194.1、281.9和250.0μmol g-1 DW,是野生型(143.7μmol g-1 DW)的1.4、2.0和1.7倍。作为细胞渗透调节剂和大分子结构保护物质,叶片甘氨酸甜菜碱含量显著增加有利于细胞在胁迫条件下维持正常的功能。取转入ApGSMT2和ApDMT2基因的T1小麦植株和野生型植株(分别为济麦19和济麦22)的叶片进行RT-PCR检测,基因ApGSMT2在转基因株系中的表达强度有差异,来自济麦19的5个转基因株系中A-19L4的表达量最低,A-19L5的表达量最高；来自济麦22的5个转基因株系中A-22L1的表达量最低,A-22L4和A-22L5株系表达强度高。甘氨酸甜菜碱含量测定结果表明,正常条件下,不同品种的转基因植株叶片甘氨酸甜菜碱含量高于野生型的,差异都达到极显著水平(P<0.01,n=4)。济麦19的转基因植株甘氨酸甜菜碱含量(84.8-113.0μmol g-1DW)比野生型济麦19 (72.2μmol g-1 DW)高17%—56%,济麦22的转基因植株甘氨酸甜菜碱含量比野生型济麦22 (74.3μmol g-1 DW)高27%—55%。可以得出来自低等真核细胞的ApGSMT2和ApDMT2基因在导入小麦后,转基因编码产物能够有效提高小麦的甘氨酸甜菜碱含量。二、转betA基因小麦的耐盐性分析选取转betA基因纯合的T2代小麦株系BL1、BL2和BL3进行耐盐性分析,确定转基因betA能否提高小麦耐盐性以及耐盐性提高的机制。冬小麦对盐胁迫的敏感期分别是出苗及小苗阶段和早春返青期,耐盐性强弱最终表现在盐碱地的经济产量。本工作重点检测了小麦出苗及小苗阶段的耐盐性,并在滨海盐碱地进行了转基因小麦的田间实验。将转基因株系的种子和野生型的种子播于大小一致的沙盆中,分别浇灌含不同浓度NaCl (0、100 mM、200 mM、300 mM)溶液,统计种子萌发率和观察长势。转基因株系的种子在盐胁迫条件下萌发率显著高于野生型,小苗生长较好。其中株系BL3在200 mM NaCl浓度处理下萌发率为94%,约为野生型的1.45倍,小苗受害程度较轻。将转基因株系和野生型的种子播在沙盆中,出苗后浇灌Hoagland营养液,5叶期开始在营养液中加入NaCl进行盐胁迫处理,NaCl浓度以每天50 mM递增至终浓度为200 mM。盐胁迫处理后,转基因植株的长势明显优于野生型植株,处理12天后BL2和BL3植株的地上部分生物量分别比野生型的高23.7%和33.8%,根生物量分别比野生型的高18.9%和34.1%。在盐胁迫条件下,无论转基因植株还是野生型植株,叶片和根中的Na+含量都明显升高,K+含量先略有升高而后降低。与野生型相比,转基因植株Na+增加量少,K+降低幅度小。在株系BL2、BL3的根和叶片中,Na+、K+含量与野生型的相比均差异显著,并且K+/Na+比值显著高于野生型的。在盐胁迫条件下,所有株系的叶绿素含量均是先有小幅度升高然后下降,但转基因植株的叶绿素含量在处理期后期显著高于野生型的。在胁迫12天时,株系BL2和BL3的叶绿素含量分别比野生型的高2倍和2.1倍。光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度以及PSⅡ光化学效率的测定结果显示,在短期盐胁迫处理下,光合速率即明显降低,降低主要由气孔导度降低引起；在长期盐胁迫处理下,光合速率大幅度降低是由于气孔导度降低和PSⅡ复合体活性受抑制共同造成的。与野生型相比,转基因植株表现出明显较高的光合速率、气孔导度和最大光化学效率(Fv/Fm),表明在盐胁迫处理中能合成较多的碳水化合物。盐胁迫条件下,叶细胞溶质势随着胁迫处理时间的延长而逐渐降低,但转基因株系BL2和BL3的溶质势显著低于野生型的,即具有更强的保水和吸收水分的能力。与野生型相比,转基因植株叶片含有较多的可溶性糖和脯氨酸。这些结果表明,在盐胁迫条件下转基因株系BL2和BL3细胞内积累了较多的可溶性物质(包括脯氨酸、可溶性糖和GB等),使细胞维持较低的溶质势,有利于细胞正常代谢和光合作用以及植株的生长。在盐胁迫条件下,转基因植株表现出较低的MDA水平和离子渗漏率,表明细胞膜受损程度小于野生型的,这与转基因植株中积累较高的甘氨酸甜菜碱水平呈显著负相关,与转基因植株有较高的PSⅡ活性相一致。表明甘氨酸甜菜碱在转基因植株中的过量积累对生物膜的稳定性和生物大分子功能产生了有益的保护作用。在滨海盐碱地种植的转基因株系和野生型对照(济南17)的试验结果表明,转基因株系尤其是BL2和BL3在盐碱地中的存活率和生长发育明显优于野生型的,经济性状如单株分蘖数、旗叶面积、单株产量等显著优于野生型对照,表现出显著提高的耐盐性。这为耐盐小麦新品种培育创造了优异材料。三、转betA基因小麦的抗旱性分析出苗期及苗期是小麦对缺水的敏感时期,此阶段干旱影响小麦出苗率和分蘖数,对产量造成很大影响。将来自济南17的转betA基因株系BL6、BL7和BL9和野生型(济南17)的种子分别在含0、10%、15%、20%、25%(W/V)PEG-6000的MS无机盐溶液中萌发,统计萌发率、根长和芽长。在25%(W/V)PEG-6000渗透胁迫条件下,BL7和BL9的种子萌发比野生型的早,芽和根的长度也分别大于野生型的,且达到显著差异水平。对小麦幼苗进行持续干旱处理,观测植株形态差异并测定地上和根系的生物量。转基因植株在干旱处理中生长较好,根系发达,生物量显著高于野生型的。不同转基因株系的耐旱性有一定差异,如BL7耐旱性最好,胁迫处理28天时地上和地下部分的生物量分别比野生型的高79.8%和38.5%。5叶期小麦幼苗持续干旱7天后,野生型植株失水严重,叶片严重萎蔫,而转基因植株叶片相对含水量较高、较伸展,萎蔫程度低。干旱胁迫条件下,转基因株系的叶绿素含量高于野生型的。干旱胁迫7天后,BL7和BL9的叶绿素含量、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率分别比野生型高45.5%和28.5%、44.7%和28.2%、71.0%和35.8%、46.9%和40.0%。干旱胁迫提高了细胞可溶性糖和脯氨酸含量,降低了小麦幼苗细胞的溶质势。其中转基因植株细胞的溶质势降低幅度较大,可溶性糖和脯氨酸的积累量显著高于野生型的。转基因细胞中较多的可溶性物质积累有利于细胞吸水和维持正常的膨压。干旱胁迫7天后,转基因株系除BL6外,其它2个株系的叶片细胞离子渗漏率和MDA含量均显著低于野生型的,说明转基因株系的细胞膜损伤和膜脂过氧化程度较轻。转基因植株的过氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性在干旱胁迫处理中明显高于野生型的,表明转基因植株在干旱胁迫条件下有较强的抗氧化能力。这些结果提示甘氨酸甜菜碱具有提高膜稳定性和稳定酶活性的作用。为了解甘氨酸甜菜碱积累在小麦转基因植株抗旱性提高中的作用,以干旱胁迫处理7天植株的叶片测定值计算可溶性糖、脯氨酸和甘氨酸甜菜碱分别对细胞渗透势的贡献。结果表明,干旱胁迫下甘氨酸甜菜碱的贡献最大,其次为可溶性糖,脯氨酸含量虽增加幅度大,但因浓度较低贡献小。甘氨酸甜菜碱含量最高的转基因株系BL7的细胞溶质势也最低。恢复浇水7天以后,转基因植株比野生型植株恢复快,表明甘氨酸甜菜碱的大量积累在转基因小麦细胞的渗透调节和减轻自由基伤害中发挥了重要作用,提高了转基因植株抗旱能力。综上所述,本工作一方面为培育抗旱耐盐小麦新品种创造了优异材料,为我国小麦生产和大面积的盐碱地开发利用做出了力所能及的贡献；另一方面为深入了解小麦抗旱、耐盐的分子机制提供了重要资料。论文创新点有：1)首次将异源甘氨酸甜菜碱合成途径引入小麦优良品种中,获得了甘氨酸甜菜碱显著提高的小麦株系,系统检测了转基因表达的遗传稳定性,获得了耐盐抗旱性明显提高的小麦新材料。2)系统检测了转betA基因小麦在盐胁迫和干旱胁迫条件下的生长发育和生理学变化,肯定了甘氨酸甜菜碱在胁迫条件下的大量积累能有效提高小麦的抗逆性,促进发达根系形成和增加细胞持水能力,有利于植物细胞维持膨压和光合作用及植株生长。3)证明了来自耐盐藻青菌Aphanothece halophytica的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶基因ApGSMT2和肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶基因ApDMT2在小麦(单子叶植物)中能有效催化甘氨酸甜菜碱合成,获得了甘氨酸甜菜碱含量高、生长发育正常的抗除草剂草甘膦的小麦优良育种材料。4)获得了一批由不同启动子分别控制的转ApGSMT2和ApDMT2基因且抗除草剂草甘膦的小麦株系,后者可用于研究转基因的不同启动子对目的基因表达和细胞甘氨酸甜菜碱积累的影响,也可用于小麦抗除草剂育种。本工作最大不足为：未对转ApGSMT2和ApDMT2基因的小麦株系进行系统的遗传学和生理学分析,降低了论文的创新性和工作的系统性。