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本研究通过16S rRNA和宏基因高通量测序，分析不同年龄奶水牛瘤胃微生物的多样性和基因功能;通过分析不同年龄阶段具有特征差异性的物种和基因功能，探索瘤胃微生物物种和基因功能随宿主年龄增长变化的规律;分析物种间相关性和物种与基因功能贡献度，试图评估瘤胃微生物之间、微生物与基因功能之间的关系随宿主年龄增长变化的规律，为今后水牛瘤胃菌群和功能调控提供理论指导依据。
1.基于16S rRNA高通量测序的奶水牛瘤胃微生物多样性分析（实验一）
选择4个年龄段，即Y组（12月龄，胎次=0）、M组（3-5岁，胎次=1）、E组（6-8岁，胎次=2）和O组（≥9岁，胎次≥3）奶水牛分别9头、7头、4头和5头，采集瘤胃液并提取总DNA，经PCR扩增后对16S rDNA的V3-V4区进行高通量测序。a多样性分析结果发现，随着年龄增长奶水牛瘤胃菌属数量(P＜0.05)和菌群丰度逐渐减少(P＜0.05);β多样性分析发现不同年龄奶水牛的菌群组成结构存在显著差异，并随年龄增加个体间的瘤胃菌群结构差异逐渐增大。门水平下，所有年龄奶水牛瘤胃的优势菌属都是拟杆菌门(Bacteroidetes)(51％-54％)、厚壁菌门（Firmicutes）(39％-29％)和变形菌门(Proteobacteria)(3.0％-7.0％)，厚壁菌门与拟杆菌门比值随宿主年龄增加而呈现逐渐变小的趋势;属水平下，拟杆菌门下占最高丰度的普雷沃氏菌属_1(Prevotella_1)(28％-37％)在四个年龄组均丰度最高，优势菌属和次级优势菌属的相对丰度随奶水牛年龄的增长呈现相互聚拢的趋势。不同年龄奶水牛瘤胃中存在着差异显著的特征性菌属，12月龄奶水牛瘤胃中以乳酸杆菌属（Lactobacillus）和糖酵菌菌属（Saccharof ermentans）为主，其含量随着年龄增长而显著减少(P＜0.05);3-5岁则以未分类梭菌目菌属（unclassified_o_Clostridiale）和未排位的双歧杆菌科菌属（norank_f_Bifidobacteriaceae）为主，显著高于12月龄和9岁或9岁以上年龄阶段(P＜0.05);9岁及以上年龄奶水牛瘤胃中的未分类普雷沃氏菌科菌属（unclassified_f_Prevotellacea）和候选单胞生糖菌属（Candidatus_Saccharimonas）丰度高于12月龄和3-5岁(P＜0.05)。共性网络（Co--occurrence）物种关联分析结果显示，奶水牛瘤胃菌群间的相关性和紧密性随着年龄增加而逐渐下降。
2.基于宏基因组测序的奶水牛瘤胃微生物功能分析（实验二）
将试验一提取的样本DNA作为宏基因测序的样本材料，选取15个DNA样品进行高通量测序，分为4个年龄组，分别为Y组（12月龄，n=5），M组（3-5岁，n=4），E组（6-8岁，n=3），O组（9岁以上含9岁，n=3）。结果发现，奶水牛瘤胃碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能随着年龄增长逐渐减弱(P＜0.05)，其中碳水化合物代谢中的淀粉和蔗糖的代谢和和氨基酸代谢氰基氨基酸的代谢减弱(P＜0.05)，低聚糖降解酶活性CH3随着年龄的增长活性显著降低(P＜0.05)，低聚糖降解酶活性CH13和CH28反之(P＜0.05)。普雷沃氏菌属（Prevotella）丰度最高，在奶水牛瘤胃纤维素降解和蛋白质合成代谢中发挥着重要作用，其基因功能中含有高度低聚糖降解酶活性的CH31、CH97、CH28等蛋白质家族。12月龄奶水牛瘤胃甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）丰度低于3-5岁和9岁以上（含9岁）奶水牛(P＜0.05);物种贡献度中还发现具有年龄特征的微生物物种，12月龄奶水牛瘤胃的乳酸菌菌属（Lactobacillus），3-5岁的双歧杆菌菌属（Bifidobacterium）和9岁以上（含9岁）奶水牛的Paludibacter菌属（Paludibacter）在各基因功能贡献度都比其余三个年龄阶段要大。乳酸菌菌属（Lactobacillus）可能具有能代谢淀粉和蔗糖相关的低聚糖降解酶活性CH3和CH109和和纤维素合成酶，乙酰氨基转移酶的活性CT2基因功能，参与瘤胃微生物碳水化合物的代谢，从而影响12月龄瘤胃的碳水化合物的代谢基因功能。
总而言之，随着年龄增长奶水牛瘤胃菌属数量和丰度逐渐减少，各年龄组间瘤胃细菌组成结构也存在明显差异;厚壁菌门（Firmicutes）/拟杆菌门（Bacteroidetes）的比值随着宿主年龄增加而逐渐变小，优势菌属和次级优势菌属的相对丰度随着宿主年龄增长呈现相互聚拢的趋势;瘤胃微生物的碳水化合物代谢以及其下的淀粉和蔗糖的代谢、氨基酸代谢功能以及其下的氰基氨基酸的代谢功能随着宿主年龄增加而逐渐减弱，低聚糖降解酶活性CH3随着年龄的增长活性显著降低，低聚糖降解酶活性CH13和CH28反之，在不同年龄阶段的瘤胃中都存在着一些差异显著的特征性菌属和基因功能;其中普雷沃氏菌属(Prevotella)丰度最高，在奶水牛瘤胃纤维素降解和蛋白质合成代谢中发挥着重要作用，其基因功能中含有高度低聚糖降解酶活性。并且随着宿主年龄的增长，发现奶水牛瘤胃菌群的之间的紧密性在下降，表明瘤胃系统的结构和功能稳定性可能在逐渐减弱。这些工作为调控奶水牛瘤胃微生物提供了基础资料。
1.基于16S rRNA高通量测序的奶水牛瘤胃微生物多样性分析（实验一）
选择4个年龄段，即Y组（12月龄，胎次=0）、M组（3-5岁，胎次=1）、E组（6-8岁，胎次=2）和O组（≥9岁，胎次≥3）奶水牛分别9头、7头、4头和5头，采集瘤胃液并提取总DNA，经PCR扩增后对16S rDNA的V3-V4区进行高通量测序。a多样性分析结果发现，随着年龄增长奶水牛瘤胃菌属数量(P＜0.05)和菌群丰度逐渐减少(P＜0.05);β多样性分析发现不同年龄奶水牛的菌群组成结构存在显著差异，并随年龄增加个体间的瘤胃菌群结构差异逐渐增大。门水平下，所有年龄奶水牛瘤胃的优势菌属都是拟杆菌门(Bacteroidetes)(51％-54％)、厚壁菌门（Firmicutes）(39％-29％)和变形菌门(Proteobacteria)(3.0％-7.0％)，厚壁菌门与拟杆菌门比值随宿主年龄增加而呈现逐渐变小的趋势;属水平下，拟杆菌门下占最高丰度的普雷沃氏菌属_1(Prevotella_1)(28％-37％)在四个年龄组均丰度最高，优势菌属和次级优势菌属的相对丰度随奶水牛年龄的增长呈现相互聚拢的趋势。不同年龄奶水牛瘤胃中存在着差异显著的特征性菌属，12月龄奶水牛瘤胃中以乳酸杆菌属（Lactobacillus）和糖酵菌菌属（Saccharof ermentans）为主，其含量随着年龄增长而显著减少(P＜0.05);3-5岁则以未分类梭菌目菌属（unclassified_o_Clostridiale）和未排位的双歧杆菌科菌属（norank_f_Bifidobacteriaceae）为主，显著高于12月龄和9岁或9岁以上年龄阶段(P＜0.05);9岁及以上年龄奶水牛瘤胃中的未分类普雷沃氏菌科菌属（unclassified_f_Prevotellacea）和候选单胞生糖菌属（Candidatus_Saccharimonas）丰度高于12月龄和3-5岁(P＜0.05)。共性网络（Co--occurrence）物种关联分析结果显示，奶水牛瘤胃菌群间的相关性和紧密性随着年龄增加而逐渐下降。
2.基于宏基因组测序的奶水牛瘤胃微生物功能分析（实验二）
将试验一提取的样本DNA作为宏基因测序的样本材料，选取15个DNA样品进行高通量测序，分为4个年龄组，分别为Y组（12月龄，n=5），M组（3-5岁，n=4），E组（6-8岁，n=3），O组（9岁以上含9岁，n=3）。结果发现，奶水牛瘤胃碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能随着年龄增长逐渐减弱(P＜0.05)，其中碳水化合物代谢中的淀粉和蔗糖的代谢和和氨基酸代谢氰基氨基酸的代谢减弱(P＜0.05)，低聚糖降解酶活性CH3随着年龄的增长活性显著降低(P＜0.05)，低聚糖降解酶活性CH13和CH28反之(P＜0.05)。普雷沃氏菌属（Prevotella）丰度最高，在奶水牛瘤胃纤维素降解和蛋白质合成代谢中发挥着重要作用，其基因功能中含有高度低聚糖降解酶活性的CH31、CH97、CH28等蛋白质家族。12月龄奶水牛瘤胃甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）丰度低于3-5岁和9岁以上（含9岁）奶水牛(P＜0.05);物种贡献度中还发现具有年龄特征的微生物物种，12月龄奶水牛瘤胃的乳酸菌菌属（Lactobacillus），3-5岁的双歧杆菌菌属（Bifidobacterium）和9岁以上（含9岁）奶水牛的Paludibacter菌属（Paludibacter）在各基因功能贡献度都比其余三个年龄阶段要大。乳酸菌菌属（Lactobacillus）可能具有能代谢淀粉和蔗糖相关的低聚糖降解酶活性CH3和CH109和和纤维素合成酶，乙酰氨基转移酶的活性CT2基因功能，参与瘤胃微生物碳水化合物的代谢，从而影响12月龄瘤胃的碳水化合物的代谢基因功能。
总而言之，随着年龄增长奶水牛瘤胃菌属数量和丰度逐渐减少，各年龄组间瘤胃细菌组成结构也存在明显差异;厚壁菌门（Firmicutes）/拟杆菌门（Bacteroidetes）的比值随着宿主年龄增加而逐渐变小，优势菌属和次级优势菌属的相对丰度随着宿主年龄增长呈现相互聚拢的趋势;瘤胃微生物的碳水化合物代谢以及其下的淀粉和蔗糖的代谢、氨基酸代谢功能以及其下的氰基氨基酸的代谢功能随着宿主年龄增加而逐渐减弱，低聚糖降解酶活性CH3随着年龄的增长活性显著降低，低聚糖降解酶活性CH13和CH28反之，在不同年龄阶段的瘤胃中都存在着一些差异显著的特征性菌属和基因功能;其中普雷沃氏菌属(Prevotella)丰度最高，在奶水牛瘤胃纤维素降解和蛋白质合成代谢中发挥着重要作用，其基因功能中含有高度低聚糖降解酶活性。并且随着宿主年龄的增长，发现奶水牛瘤胃菌群的之间的紧密性在下降，表明瘤胃系统的结构和功能稳定性可能在逐渐减弱。这些工作为调控奶水牛瘤胃微生物提供了基础资料。