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本文对抗东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensisi)的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株H-13的特性进行了研究。研究结果表明,Bt菌株H-13的伴孢晶体为菱形,由128kDa的原毒素蛋白组成,经胰蛋白酶水解得到62kDa的核心毒素:H-13含有4个质粒,其中有一个大质粒;其杀虫晶体蛋白质基因定位在染色体上。
用生物测定的方法研究了H-13抗东亚飞蝗的活性,比较了发酵液,发酵液处理液,提纯的晶体,晶体酶解产物对东亚飞蝗的毒力,确定了H-13抗东亚飞蝗的活性成分。结果显示:感染东亚飞蝗72小时,发酵液的LC50为39.81μL mL-,50倍稀释液的杀虫率为37.5%;发酵液处理液LC50为4.3068μL mL-,50倍稀释液的杀虫率达89.8%;提纯的晶体LC50为1.69 mg mL-,浓度为2.0 mg mL-时,杀虫率为58.0%;晶体酶解产物LC50为0.651mg mL-,浓度为2.0 mg mL-时杀虫率高达98.7%。用发酵液处理液对成虫进行生物测定,经过7天的喂食,H-13菌株的杀虫率达到75%;这说明发酵液与晶体经处理后抗蝗虫的活性高,杀虫速度快。同时用免疫荧光技术对死亡成虫肠道中的杀虫晶体蛋白质进行了检测,在死亡成虫中肠膜细胞中检测到大量的H-13杀虫毒素的存在,这一结果也表明H-13抗东亚飞蝗的活性成分为杀虫晶体蛋白质。
用简并性引物,采用两步PCR技术,扩增了H-13菌株杀虫晶体蛋白质核心毒素的基因片段,并进行了测序。通过生物软件NCBI BLAST将该片段编码的氨基酸序列与其它Bt杀虫蛋白质进行比对,发现其仅与Cry8Aa的同源性达到34%。
通过用DNAstar软件对已克隆的基因片段序列上的酶切位点分析,用BamHⅠ,HindⅢ,EcoRⅠ三种酶对H-13的总DNA进行完全消化。通过用特异性引物PCR扩增的产物为探针对三种酶消化的总DNA进行的Southern杂交,结果显示含有目的基因的EcoR Ⅰ酶切片段较大,回收片段克隆较困难,BamH Ⅰ酶切片段较小,而HindⅢ酶切得到的片段在4000bp左右。克隆含目的基因的片段得到阳性克隆子pH-6。目的片段的测序正在进行之中。