近年来,一系列研究证实从天然中草药中提纯的活性成分可有效治疗人类疾病。异甘草素(Isoliquiritigenin, ISL),化学结构为2’,4’,4’-三羟基查尔酮,是从中草药甘草中提取的黄酮类化合物。已被证实其生物安全性好,生物活性强,具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种作用,也是防治骨破坏疾病的潜在药物。多种骨破坏疾病的共同病理改变为破骨细胞异常增多,而起源于单核巨噬细胞系的破骨细胞是目前已知的唯一具有骨吸收功能的多核细胞。核因子-KB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)是刺激破骨细胞增殖、分化和成熟的重要因子。细菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)可引发机体炎性反应,促进破骨细胞形成,导致炎症性骨破坏。一些研究(包括我们实验室研究)证实天然黄酮类化合物异甘草素能抑制体内RANKL诱导的破骨细胞分化及体外LPS引发的骨破坏。但异甘草素抑制破骨细胞作用的机制却不明确。自噬被认为是人体内多种生理病理过程的重要机制,主要维持细胞稳态。自噬途径由多种自噬蛋白参与并调节,LC3 (microtubule-associated protein light chain 3)和Beclin 1是其标志蛋白。自噬水平与破骨细胞分化及功能密切相关。黄酮类化合物多种生物活性与自噬途径也有着一定联系。但异甘草素调节骨代谢时自噬变化及作用还有待研究。本课题拟通过体外和体内实验探讨异甘草素抑制破骨细胞分化时自噬的可能变化,并进一步研究此过程中相关信号通路。以期为异甘草素防治溶骨性疾病提供可能机制,有助于设计防治破骨细胞相关骨疾病的新方案。第一部分异甘草素影响NF-κB途径调节自噬抑制破骨细胞分化的体外研究目的：通过体外实验探讨自噬在异甘草素抑制RANKL诱导的破骨细胞分化中作用,并进一步分析在此过程中NF-κB (Nuclear factor-kappa B)信号通路对自噬的调节作用。方法：RANKL和不同浓度异甘草素作用于RAW 264.7细胞。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色用于评估破骨细胞的形成,鬼笔环肽染色和扫描电镜观察评价破骨细胞吸收功能。CCK-8 (Cell Counting Kit-8)试剂盒检测细胞活性。MDC染色、免疫荧光、透射电镜观察、western blot和实时定量PCR (quantitative real-time PCR)用于检测自噬特异性反应。然后雷帕霉素(Rapamycin)预刺激RAW264.7细胞后,再加入RANKL和异甘草素。通过TRAP、鬼笔环肽观察破骨细胞形成及功能,实时定量PCR检测破骨细胞分化相关因子表达。最后观察Bay 11-7082作用于RAW 264.7细胞后NF-κB途径及自噬的变化。结果：首先我们发现异甘草素减少RANKL诱导形成的破骨细胞数目,抑制自噬标志蛋白LC3-Ⅱ和Beclin 1的聚集。进一步实验显示异甘草素刺激破骨前体细胞后自噬水平明显降低,包括酸性泡形成、脂化LC3-Ⅱ聚集以及自噬体产生等多种自噬特征性改变被阻断。同时RANKL刺激破骨前体细胞时自噬相关基因及蛋白表达水平上升,异甘草素处理后却显著下调。此外,自噬诱导剂雷帕霉素几乎可以逆转异甘草素抑制破骨细胞分化功能。同时异甘草素抑制RANKL诱导的NF-κB表达和核转位,且NF-κB抑制剂Bay 11-7082也有效干扰RANKL刺激自噬活化。结论：阻断NF-κB通路调控的自噬途径很有可能是异甘草素抑制体外破骨细胞分化的重要机制。第二部分异甘草素干扰自噬和NF-κB途径对抗破骨细胞分化和骨吸收的体内研究目的：通过建立小鼠颅盖骨炎性骨吸收模型探讨在异甘草素抑制破骨细胞保护骨组织过程中自噬和NF-κB途径的可能作用。方法：5w的BABL/c小鼠随机平分为三组,两组在颅盖骨部位皮下注射LPS,其中一组提前半小时腹腔注射ISL,第三组皮下注射PBS。一周后,取颅盖骨行micro-CT扫描和骨密度检测,脱钙包埋后切片,TRAP、HE染色和蛋白酶K(cathespin K)免疫荧光检测骨破坏和破骨细胞,接着利用免疫组化和免疫荧光检测LC3-Ⅱ和NF-κB p65的表达。结果：与体外实验结果一致,腹腔注射异甘草素明显抑制LPS诱导的小鼠颅盖骨破骨细胞形成与骨吸收,并显著降低破骨相关因子蛋白酶K、自噬蛋白LC3以及NF-κB p65表达水平。结论：异甘草素下调自噬和NF-κB途径抑制体内破骨细胞形成和炎性骨吸收。